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        革兰氏染色法

        相关实验:病原生物的基本形态结构观察实验

        最新修订时间:

        原理

        微生物的细胞小且透明,在普通光学显微镜下不易识别,必须对它们进行染色,使经染色后的菌体与背景形成明显的色差,从而能更清楚地观察到其形态和结构。因此,微生物染色技术是观察微生物形态结构的重要手段。 (注:任何一项技术都不是完美无缺的。染色后的微生物标本是死的,在染色过程中微生物的形态与结构均会发生一些变化,不能完全代表其生活细胞的真实情况,染色观察时必须注意。)
         
        细菌的等电点较低,pH值大约在2—5 之间,故在中性、碱性或弱酸性溶液中,菌体蛋白质电离后带阴电荷;而碱性染料电离时染料离子带阳电。因此,带阴电的细菌常和带阳电的碱性染料进行结合。所以,在细菌学上常用碱性染料进行染色。影响染色的其它因素,还有菌体细胞的构造和其外膜的通透性,如细胞膜的通透性、膜孔的大小和细胞结构完整与否,在染色上都起一定作用。此外,培养基的组成、菌龄、染色液中的电介质含量和pH、温度、药物的作用等,也都能影响细菌的染色。
         
        微生物染色方法一般分为单染色法和复染色法两种。前者用一种染料使微生物染色,但不能鉴别微生物。复染色法是用两种或两种以上染料,有协助鉴别微生物的作用。故亦称鉴别染色法。常用的复染色法有革兰氏染色法和抗酸性染色法,此外还有鉴别细胞各部分结构的(如芽胞、鞭毛、细胞核等)特殊染色法。微生物检验中常用的是单染色法和革兰氏染色法。
         
        革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884 年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法(Gram stain)不仅能观察到细菌的形态,而且还可将所有细菌区分为两大类:染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌,用G+表示;染色反应呈红色(复染颜色)的称为革兰氏阴性细菌,用G-表示。细菌对革兰氏染色的不同反应,是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的,在染色过程中,当用乙醇处理时,由于脱水而引起网状结构中的孔径变小,通透性降低,使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色,因此,呈现蓝紫色;革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低,而脂类物质含量高,当用乙醇处理时,脂类物质溶解,细胞壁的通透性增加,使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色,然后又被染上了复染液(复红)的颜色,因此呈现红色。
         
        革兰氏染色需用四种不同的溶液:碱性染料(basic dye)初染液;媒染剂(mordant);脱色剂(decolorising agent)和复染液(counterstain)。用于革兰氏染色的初染液一般是碱性染料初染液结晶紫(crystal violet)。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力,即以某种方式帮助染料固定在细胞上,使不易脱落,碘(iodine)是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色,不同类型的细胞脱色反应不同,有的能被脱色,有的则不能,脱色剂常用95%的酒精(ethanol)。复染液也是一种碱性染料,其颜色不同于初染液,复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色,而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色,而且将细胞区分成G+和G-两大类群,常用的复染液为稀释的石炭酸复红液。

        材料与仪器

        步骤

        一、试剂与器材
         
        1.  器材:牙签、显微镜、载玻片、酒精灯、染色缸等。
         
        2.  染色液:革兰氏染色液一套(结晶紫染色液、碘液、95%乙醇、稀释石炭酸复红液)。
         
        二、细菌标本片的制作
         
        1.  涂片
         
        在干净的载玻片上滴1 滴蒸馏水,用牙签挑取牙垢少许,置载玻片的水滴中,与水混合做成悬液并涂成直径约1 厘米的薄层。
         
        2.  干燥
         
        涂片最好在室温下使其自然干燥,有时为了使之干得更快些,可将标本面向上,手持载玻片一端的两侧,小心地在酒精灯上高处微微加热,使水分蒸发,但切勿紧靠火焰或加热时间过长,以防标本烤枯而变形。
         
        3.  固定
         
        标本干燥后即进行固定,固定的目的有三个:
         
        (1)杀死微生物,固定细胞结构。
         
        (2)保证菌体能更牢的粘附在载玻片上,防止标本被水冲洗掉。
         
        (3)改变染料对细胞的通透性,因为死的原生质比活的原生质易于染色。
         
        固定常常利用高温,手执载玻片的一端(涂有标本的远端),标本向上,在酒精灯火焰外层尽快的来回通过3-4次,共约2-3秒钟,并不时以载玻片背面加热触及皮肤,不觉过烫为宜(不超过60℃),放置待冷后,进行染色。
         
        三、染色
         
        1.  初染

        加结晶紫1 滴,约1 分钟,水洗。
         
        2.  媒染

        滴加碘液冲去残水,并覆盖约1 分钟,水洗。
         
        3.  脱色

        将载玻片上的水甩净,并衬以白背景,用95%酒精滴洗至流出酒精无色或稍呈淡紫色时为止,约20-30 秒钟,立即用水冲净酒精。
         
        4.  复染

        用稀释石炭酸复红液染30 秒后,水洗。
         
        5.  镜检

        用吸水纸干燥后,置油镜观察。
         
        四、结果判断
         
        革兰氏阴性菌呈红色,革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准,过于密集的细菌,常常呈假阳性。
         

        注意事项

        1.  革兰氏染色成败的关键是脱色时间,如脱色过度,革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阴性菌;如脱色时间过短,革兰氏阴性菌也会被误认为是革兰氏阳性菌。因此必须严格把握脱色时间。
         
        2.  若选用培养细菌染色,选用18—24 小时菌龄的细菌为宜,若细菌太老,由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。

        常见问题

        一、革兰氏染色液的配制
         
        1.  结晶紫(crystal violet)液

        结晶紫乙醇饱和液(结晶紫2 g溶于20 mL95%乙醇中)20 mL,1%草酸铵水溶液80 mL 将两液混匀置24 h 后过滤即成。此液不易保存,如有沉淀出现,需重新配制。
         
        2.  卢戈(Lugol)氏碘液

        碘1 g,碘化钾2 g,蒸馏水300 mL。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中,然后加入碘使之完全溶解,再加蒸馏水至300 mL 即成。配成后贮于棕色瓶内备用,如变为浅黄色即不能使用。
         
        3.  95%乙醇

        用于脱色,脱色后可选用以下(4)或(5)的其中一项复染即可。
         
        4.  稀释石炭酸复红溶液

        碱性复红乙醇饱和液(碱性复红1 g,95%乙醇l0 mL,5%石炭酸90 mL混合溶解即成碱性复红乙醇饱和液),取石炭酸复红饱和液l0 mL 加蒸馏水90 mL 即成。
         

        来源:丁香实验

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