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        电泳法

        相关实验:DNA 的琼脂糖凝胶电泳实验

        最新修订时间:

        原理

        DNA琼脂糖凝胶电泳的基本原理是利用DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时具有的电荷效应和分子筛效应。

        电荷效应是指DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电,在电场中向正极移动,且相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷,能以相同速率移动。通常,DNA泳动速率随DNA片段长度的增加而减少,与电场强度成正比。

        分子筛效应是指作为支持介质的琼脂糖,具有网络结构,使大分子物质在通过时收到较大阻力,依此分离不同大小的DNA片段。一般,DNA琼脂糖凝胶电泳可分离50bp到百万bp长度的DNA片段,视实际需求配制不同浓度和构型的琼脂糖凝胶。


        材料与仪器

        步骤

        1.  用胶带将洗净、干燥的制胶板的两端封好,水平放置在工作台上;

        2.  调整好梳子的高度;

        3.  称取0.24 g琼脂糖于30 ml 0.5×TBE中,在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解,冷却至45-50篊时倒入制胶板中;

        4.  凝胶凝固后,小心拔去梳子,撕下胶带;

        5.  将电泳样品与溴酚蓝混合后将样品依次点入加样孔中;
        pUC185祃+ddH2O3祃+溴酚蓝2祃共10祃于0.5 ml tube中混合后点样;

        6.  将制胶板放入电泳槽中,加入电泳液,打开电泳仪,使核酸样品向正极泳动;

        7.  电泳完成后切断电源,取出凝胶,放入0.5礸/ml的溴化乙锭(EB)溶液中染色10-15min,清水漂洗后置于紫外透射仪上观察电泳结果,并照相记录。

        注意事项

        1.  影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素:

        (1)DNA分子大小与迁移速率U与logN成反比(N为碱基对数目)。分子大小相等,电荷基本相等(DNA结构重复性)。分子越大,迁移越慢。等量的空间结构紧密的电泳快(超螺旋>线性DNA)

        (2)胶浓度,U为迁移率,U0t 琼脂糖浓度:logU=logU0 Kr 为胶浓度,Kr为介质阻滞系数。不同的凝胶浓度,分辨不同范围的DNAt为DNA的自由电泳迁移率,
         
         

        电泳法


        (3)DNA构象:一般迁移速率超螺旋环状>线状DNA>单链开环。当条件变化时,情况会相反,还与琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及EB含量有关。

        (4)所加电压:低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。使分辨效果好,凝胶上所加电压不应超过5 V/cm

        (5)碱基组成与温度:一般影响不大4 -30 ℃

        (6)嵌入染料的存在:降低线性DNA迁移率,(不提倡加在电泳液中)

        (7)电泳缓冲液 (0.5×TBE)的组成及其离子强度影响DNA的迁移率,无离子存在时,核酸基本不泳动,离子强度过大产热厉害,熔化凝胶并导致DNA变性,一般采用1×TAE,1×TBE,1×TPE(均含EDTA pH8.0)。

        2.  溴化乙锭(EB)为致癌剂,操作时应戴手套,尽量减少台面污染。

        3.  电泳指示剂:核酸电泳常用的指示剂有两种,溴酚蓝(bromophenol blue, Bb)呈蓝紫色;二甲苯晴(xylene cyanol, Xc)呈蓝色,它携带的电荷量比溴酚蓝少,在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。

        常见问题

        常见问题原因分析


        1. 跑出的DNA带模糊?


        (1)DNA降解:避免核酸酶污染。


        (2)电泳缓冲液不新鲜:电泳缓冲液多次使用后,离子强度降低,pH值上升,缓冲能力减弱,从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液。


        (3)所用电泳条件不合适:电泳时电压不应超过20V/cm,温度<30℃;巨大DNA链电泳,温度应<15℃;核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。


        (4)DNA上样量过多:减少凝胶中的DNA上样量。


        (5)DNA样含盐过高:电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。


        (6)有蛋白污染:电泳前酚抽提去除蛋白。


        (7)DNA变性:电泳前勿加热,用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。


        2. 有不规则DNA带迁移?


        (1)对于λ/Hind III片段cos位点复性:电泳前于65℃加热DNA 5分钟,然后在冰上冷却5分钟。


        (2)电泳条件不合适:电泳时电压不应超过20V/cm,温度<30℃;经常更换电泳缓冲液。


        (3)DNA变性:电泳前勿加热,用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。


        3. 跑出的DNA条带弱或无条带?


        (1)DNA的上样量不够:增加DNA的上样量。


        (2)DNA降解:避免DNA的核酸酶污染。


        (3)DNA走出凝胶:正确连接电极方向避免插反的情况,缩短电泳时间,降低电压,增强凝胶浓度。


        (4)所用光源不合适:对于用EB染色的DNA应用短波长(254nm)紫外光源。


        4. 跑出的DNA带缺失不完整?


        (1)如果是小DNA带,可能跑出凝胶,可以缩短电泳时间或降低电压或增强凝胶浓度。


        (2)分子大小相近的DNA带不易分辨,应延长电泳时间,并核准正确的凝胶浓度。


        (3)DNA变性:电泳前勿加热,用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。

        实验方法出处来源《分子克隆实验指南

        来源:丁香实验

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