比色法

酚磺酞（phenolsufon phthaleinl, psp）商品名为酚红（分子量354.38），为一种常用的指示剂，在碱性环境中呈紫红色。静脉注射psp后，因其在体内不被代谢，不易通过毛细血管进入组织，故可用比色法测定给药后不同时间的血浆psp的吸光度，通过外标记法计算出血浆psp的浓度；又因psp在体内满足一级消除动力学，故可由给药时间和相应血药浓度，计算药物半衰期表观分布容积。

一、绘制酚红的标准曲线

取 1、2、4、8、16 umol·Lˉ1PSP标准溶液及蒸馏水各1.55 ml，再加入1 mol·Lˉ1NaOH溶液0.05 ml匀。于560 nm 波长处比色测定标准溶液的吸光度并绘制出酚红的标准曲线，有亦可用计算器或将酚红的不同标准浓度与其相应的吸光度作直线回归，可得标准曲线的直线回归方程：

 

Y=a+bX  X: 酚红的标准浓度； Y: 吸光度（A）

二、给药后不同时间血液中酚红的浓度测定

取健康家兔一只，称重，放入兔盒内。从一侧耳静脉取血1 ml 置于干燥含肝素的试管中，振摇，供空白对照，然后从同侧耳静脉注射0.6%酚红溶液6 mg/kg，给药后5、10、20和30 min 分别从另一侧耳静脉取血1 ml, 置于含肝素的试管中，振摇。离心10 min（转速为1500 r/min）。分别取上清液0.1 ml,置于到5 只试管中，各加入稀释液1.5 ml, 摇匀后静置5 min。用721 型分光光度计，于560 nm波长处依次进行比色测定，记隶其吸光度。

三、结果
 

用计算器或计算机调用直线回归程序（附后），计算出不同时间酚红的血浆浓度，具体操作步骤如下：

1.  酚红标准曲线（浓度-吸光度关系曲线）。

2.  用上述标准曲线，求得不同的吸光度所对应的浓度值，将此浓度值乘以16 即可求得给药后不同时间所对应的血浆酚红浓度。

3.  根据一级消除动力学公式㏒ C1= ㏒ C0-Kt/2.303

将给药时间t 与已求得不同的psp血浆浓度对数植㏒ C1 再作线性回归，即可得该回归方程的斜率（-K/2.303）和截距（㏒ C0）。将K 和C0带入公式t1/2=0.693/K 和V4 =D/ C0（D为给药剂量），便可求得t1/2和Vd。

⒈  取血前，应除去兔耳部位的毛，以免影响血凝。
 

⒉  取血前，应使兔耳耳缘静脉充分扩张，充盈以利取血。
 

⒊  离心时应注意试管的平衡，以免损坏离心机。
 

⒋  禁止用手触摸比色皿的光滑面，若溶液流出，只能用擦镜纸擦拭，以免光面。

不同的人，其有效的药物剂量变动很大，但是其安全有效的血药浓度变动却较小。一般不过1倍左右。当血药浓度大于安全有效范围，其毒副作用和表现及其程度在不同病人身上变动也较小。再举苯妥英钠的例子，该药的安全有效血浓度范围在几乎所有病人均为10～20毫克/升。同样当苯妥英钠的血浓度超过安全范围，几乎所有病人都出现中毒反应。当血药浓度为20～30毫克/升时，病人则出现精神异常现象。