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        化学发光法

        相关实验:非标记蛋白质的磷酸化作用分析实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        1.  如基本方案步骤1所述,用SDS-聚丙烯醜胺凝胶电泳分离样品,使用含100 μmol/l 钒酸钠的转移液将蛋白质转印至硝酸纤维素滤膜上。 

        2.  在塑料容器内,膜与不含叠氮钠的封阻液在室温温育至少30 min。

        3.  室温下膜与30~50 ml 抗磷酸酪氨酸抗体温育60~120 min,间或摇动。 

        4.  在一干净的塑料容器内,用TN缓冲液冼膜2次,每次10 min;用含0.05%NP-40的TN缓冲液洗膜2次;毎次10 min 再用TN缓冲液洗膜2次,毎次5 min 弃冼液。 

        5.  加入30~50 ml 针对第一抗体的过氧化物酶偶联的第二抗体,室温温育60 min,间或摇动。 

        6.  如步骤4所述洗膜。
         
        7.  在比膜稍大的塑料容器内,等体积混合用于ECL检测的鲁米诺试剂和氧化剂。 

        8.  将膜(含蛋白质样品的一面朝上)浸入混合试剂,轻摇60 s。

        9.  取出膜,沥干多余液体,置于塑料保护膜内,蛋白质朝上。 

        10.  在暗室内对X光片曝光15 s~30 min。

        来源:丁香实验

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