• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        一步法

        相关实验:低丰度核酸反转录及扩增实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        实验材料
        试剂、试剂盒
        仪器、耗材

        步骤

        1.  用过氧化物酶,蛋白酶K和DNA酶预处理载玻片。

        2.  配置如下一步反应体系(总体积100 μl)

        (1)0.5 μl 100 μmol/l 正向引物(终浓度0.5 μmol/l)

        (2)0.5 μl 100 μmol/l 反向引物(终浓度0.5 μmol/l)

        (3)6 μl 3 mmol/l 4dNTP混合物(终浓度0.12 mmol/l)

        (4)2 μl 10 mmol/l MnCl2(终浓度0.2 mmol/l)

        (5)10 μl 25 mmol/l MgCl2(终浓度2.5 mmol/l)

        (6)2 μl 10×rTth 转录缓冲液(终浓度0.2×)

        (7)8 μl 10×螯合缓冲液(终浓度0.8×)

        (8)10 μl 1.7 mg/ml BSA(终浓度0.17 mg/ml)

        (9)2 μl 2.5 U/ml rTth DNA聚合酶(终浓度9.05 U/ml)

        (10)29 μl DEPC处理过的水
         
        3.  用20 μl 吸头加8 μl(如用3孔载玻片)或12~20 μl (如用单孔载玻片)原位PCR扩增体系于各孔上,该液体覆盖整个孔表面。

        4.  放20 mm×60 mm 盖玻片于每一载玻片上,小心用指甲油封住盖玻片边缘。
         
        5.  在92℃加热块上,温育玻片90 s。然后转至热循环仪。

        6.  用步骤2所配一步反应体系代替原位PCR反应体系。

        7.  按如下温度循环程序进行反转录:

        (1)1个循环:15 min,70℃

        (2)3 min,92℃

        (3)15 min,70℃

        (4)3 min,92℃

        (5)15 min,70℃

        8.  按如下温度循环程序进行原位PCR:

        (1)29个循环:1 min,93℃(变性)

        (2)1 min,53℃(退火)

        (3)1 min,72℃(延伸)

        (4)最后一步:不定,4℃(维持)

        9.  由热循环仪上取下载玻片,浸于100%乙醇中≥5 min 溶解指甲油,用剃须刀或其他小刀橇开盖玻片,刮去残留的指甲油,以便在杂交/检测步骤中能平放上新的盖玻片。

        10.  在92℃加热块上温育玻片1 min,然后于室温下用2×SSC浸泡5 min。玻片在4℃可存敢2~3周。

        来源:丁香实验

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序