材料与仪器
步骤
一、来源于哺乳动物细胞
1. 按“CAT活性的层析分析法”中的步骤1~5的冻融法，制备哺乳动物细胞提取物。如果用胰蛋白酶消化或制细胞方法来收集细胞，则将原位裂解法的步骤1至4用以下的步骤2至4代替。
二、来源于植物原生质体
1. 按“CAT活性的层析分析法”中的步骤1~5的冻融法，制备哺乳动物细胞提取物。如果用胰蛋白酶消化或制细胞方法来收集细胞，则将原位裂解法的步骤1至4用以下的步骤2至4代替。
2. 室温下，300 g 离心5 min，弃去上清。每107细胞加入1 ml 低渗缓冲液，离心，弃上清。然后每107细胞加Triton裂解液200 μl。
二、来源于植物原生质体
1. 室温下，2 000~4 000 g 离心5 min，将植物原生质体细胞收集于1.5 ml 的微量离心管中，弃去上清。
2. 往细胞沉淀加50 μl 低渗缓冲液，在旋涡混合器上剧烈振荡，将离心管置于-70℃ 15 min以上，或置于干冰/乙醇浴中5 min 以冻结样品。融解样品，在室温下13 000 g 离心2 min，将上清移入一个干净管中。
3. 对于分析50 μl 细胞提取液，配置如下CAT分析混合液
2. 往细胞沉淀加50 μl 低渗缓冲液，在旋涡混合器上剧烈振荡，将离心管置于-70℃ 15 min以上，或置于干冰/乙醇浴中5 min 以冻结样品。融解样品，在室温下13 000 g 离心2 min，将上清移入一个干净管中。
3. 对于分析50 μl 细胞提取液，配置如下CAT分析混合液
20 μl 0.01 μCi/μl ［3H］氯霉素
5 μl 5 mg/ml 丁酰辅酶A
5 μl 2 mol/l Tris·Cl，pH8.0
20 μl H2O
5 μl 5 mg/ml 丁酰辅酶A
5 μl 2 mol/l Tris·Cl，pH8.0
20 μl H2O
4. 对每组分析，将50 μl CAT分析混合液加入50 μl 细胞提取液中。37℃温育30~90 min。
5. 用200 μl 2：1的TMPD/二甲苯剧烈报荡提取乙酰化的氯霉素，离心并移出上层液相至一只闪烁瓶中。
6. 样品中加3~5 ml 闪烁液，计数测定CAT的活性。
6. 样品中加3~5 ml 闪烁液，计数测定CAT的活性。
来源：丁香实验
