变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验
最新修订时间：
原理
本方法由于快捷、简便及具髙分离度，对纯化寡核苷酸非常有用。尽管得到率偏低（＜50%），回收的量通常却大大超过了大多数分子生物学应用所需的量步骤亦可用于分离小RNA或其他单链多聚核苷酸。
材料与仪器
步骤
1. 用浓氨水将合成的寡核苷睃从可控孔度玻璃拄上洗脱下来。于55℃加热5 h 以上。
2. 样品移至离心管中，在Speedvac真空旋转蒸发仪中冻干，沉淀用0.2 ml 的水重悬。
3. 装好灌胶装置，准备合适的凝胶溶液（表1）。对于10 cm×16 cm×1.6 mm 大小的凝胶，在一个真空过滤瓶中棍合下列成分：
（1）25.2 g 尿素（终浓度7 mol/l）
（2）6 ml 10xTBE 电泳缓冲液
（3）40%丙烯酰胺/2%亚甲双丙烯酰胺溶液（所需量）
（4）加水至60 ml
（5）脱气10 min，加入200 μl10%的过硫酸铵及30 ul 的TEMED。混合后灌胶，室温下让胶聚合30 min 以上。
4. 拔去梳子，将凝胶板固定在电泳槽上，用1xTBE下缓冲液注满上层及下层槽。
5. 加样前用2x甲酰胺加样缓冲液将样品作对倍稀释。
6. 每一个2 cmx1.6 mm 孔中可以加入2 umol 合成量的25%。
7. 得到一个清哳的结果约需10 μg（50 μl 重悬样品+50 ul 2x甲酰胺加样缓冲液=每孔100 ul）。
2. 样品移至离心管中，在Speedvac真空旋转蒸发仪中冻干，沉淀用0.2 ml 的水重悬。
3. 装好灌胶装置，准备合适的凝胶溶液（表1）。对于10 cm×16 cm×1.6 mm 大小的凝胶，在一个真空过滤瓶中棍合下列成分：
（1）25.2 g 尿素（终浓度7 mol/l）
（2）6 ml 10xTBE 电泳缓冲液
（3）40%丙烯酰胺/2%亚甲双丙烯酰胺溶液（所需量）
（4）加水至60 ml
（5）脱气10 min，加入200 μl10%的过硫酸铵及30 ul 的TEMED。混合后灌胶，室温下让胶聚合30 min 以上。
表1、变性聚丙胺凝胶电泳能使相应片段达到最适分离度的丙烯酰胺浓度
4. 拔去梳子，将凝胶板固定在电泳槽上，用1xTBE下缓冲液注满上层及下层槽。
5. 加样前用2x甲酰胺加样缓冲液将样品作对倍稀释。
6. 每一个2 cmx1.6 mm 孔中可以加入2 umol 合成量的25%。
7. 得到一个清哳的结果约需10 μg（50 μl 重悬样品+50 ul 2x甲酰胺加样缓冲液=每孔100 ul）。
8. 临加样前用移液器上下吹打TBE缓冲液数次以彻底洗涤样品孔。
9. 加样，在约5 V/cm2电压降下电泳至溴酚蓝到达胶底部。
9. 加样，在约5 V/cm2电压降下电泳至溴酚蓝到达胶底部。
10. 将凝胶板从电泳槽中取出，水平放置，撬开上层板。
11. 用塑料膜覆盖凝胶，将板翻转，将凝胶的一角揭离玻璃板，放在塑料膜上，再用另一张塑料膜覆盖凝胶。
12. 将凝胶放在带荧光指示剂的薄层层析板上，用短波紫外灯跟踪观察条带，条带将在绿色背景下显示暗迹。
11. 用塑料膜覆盖凝胶，将板翻转，将凝胶的一角揭离玻璃板，放在塑料膜上，再用另一张塑料膜覆盖凝胶。
12. 将凝胶放在带荧光指示剂的薄层层析板上，用短波紫外灯跟踪观察条带，条带将在绿色背景下显示暗迹。
13. 一个干净的解剖刀将条带直接切下或用墨水标记后切出，剥去塑料膜，将胶条转移至离心管中。
14. 每2 cm 的胶条加0.5 ml 的0.3 mol/l 乙酸钠，室温下在旋转揺床上洗脱过夜。
15. 将溶液转移至一个干净的离心管中，不要带入丙烯酰胺碎片。
16. 用等体积的酚抽提1次，氯仿抽提1次，乙醇沉淀，干燥，样品用TE缓冲液或水重悬。
15. 将溶液转移至一个干净的离心管中，不要带入丙烯酰胺碎片。
16. 用等体积的酚抽提1次，氯仿抽提1次，乙醇沉淀，干燥，样品用TE缓冲液或水重悬。
注意事项
1. 灌胶后一旦拔去梳子，必须立即彻底清洗加样孔，否则由梳子带出的少量聚丙烯酰胺将会在孔中聚合，从而产生会使 RNA 条带变形的形状不规则的加样孔底面。
2. 最好用同批配制的电泳缓冲液配胶和电泳，因为离子强度或 pH 值的细微差异都会产生缓冲液前沿，使 RNA 的迁移发生严重变形。
3. 在电泳前最好进行预电泳，使过硫酸铵迁移出样品孔，并能将凝胶加温至最适于 RNA 电泳的温度。
来源：丁香实验
