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        紫外分光光度法

        相关实验:核酸纯度、浓度与分子量测定实验

        最新修订时间:

        原理

        溴化乙锭是一种荧光染料,在凝胶电泳中,EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间,在紫外线激发下发出荧光,其强度与DNA量成正比。同时核酸最大吸收波长在260 nm,在此波长下,吸光度1 A相当于一定浓度的核酸,可以通过A260/A280 的比值,来测定所得核酸的纯度。


        利用一系列不同浓度的DNA标准溶液(0、2.5、5、10、20、30、40、50 ng/ml),或已知浓度的DNA marker,和未知浓度DNA样品一起进行琼脂糖凝胶电泳,以EB染色后,在凝胶图象分析仪上观察,比较标准浓度及未知浓度的亮度,来求取DNA 的含量。


        比较DNA样品与DNA marker条带位置,推知DNA 样品分子量。


        材料与仪器

        步骤

        一、核酸的纯度测定

        1.  将分光光度计打开,预热10分钟。


        2.  将核酸溶液中取2 µl,加(或纯水)使体积成为100 µl。


        3.  将稀释溶液加入石英管,以TE buffer(或纯水)为标准倒入另一管。


        4.  在波长260、280 nm 处测定吸光值。


        5.  比较在260 nm 及280 nm 之读值。


        二、DNA含量和分子量的测定


        1.  称取1.5 g 琼脂糖加入盛有100 ml 0.5×TBE电泳缓冲液三角瓶中,摇匀,在微波炉上加热至琼脂糖完全溶解。加入溴化乙锭(EB)至终浓度0.5 ug/ml,并摇匀。 


        2.  用胶带将制胶板两端封好,插入适当梳子,将溶解的琼脂糖倒入,室温冷却凝固。 


        3.  充分凝固后撕掉两端的胶布,垂直向上小心拔出梳子,以保证点样孔完好。凝胶置入电泳槽中,加0.5×TBE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1~2 mm。


        4.  用移液器吸取DNA样品8 μl 与 2 μl 的载样缓冲液混匀,小心加入点样孔,蓝色样品混合物将沉入点样孔下部。同时点10 μl DNA Marker作为分子量标准。 


        5.  打开电源开关,调节电压至3-5 V/cm,可见到条带由负极向正极移动,约半小时后即可观察。 


        6.  在凝胶图象分析仪上观察电泳带及其位置,并与核酸分子量标准比较被扩增产物的大小;同时比较标准浓度及未知浓度的亮度,求取DNA 的含量。

        注意事项

        1.  A260/A280>1.8表示DNA/RNA的纯度高。若数值<<1.8,表示纯度低,这时由OD260测得的DNA含量较不可信,核酸溶液中含有较多蛋白质,因此最好将前述所得核酸再重新抽取。

        2.  EB是致癌物质,切勿用手接触,更不要污染环境。

        常见问题

        测定260 nm 吸光值,OD=1.0代表值如下:

         

        (1)ds DNA (double stranded DNA) = 50 mg/ml

         

        (2)ss DNA (single stranded DNA or simgle-stranded RNA) = 40 mg/ml

         

        (3)oligonucleotide = 33 mg/ml

        来源:丁香实验

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