细胞培养技术

1.  用DEM培养液洗涤对数生长期的肿瘤细胞，收集并重新悬浮细胞于DEM培养液中。

2.  悬浮的肿瘤细胞与1.2%藻酸钠溶液混合，稀释后的藻酸钠浓度为0.8%，细胞浓度为（1~5）x10⁶细胞/ml。

3.  把0.8%藻酸钠的肿瘤细胞稀释液装入喷雾器内，用力使液体压出喷嘴。

4.  当水溶性的藻酸钠与80 mmol/l CaCl₂混合，Na⁺被Ca²⁺取代后变成胶。

5.  空气压力和喷出的速度决定藻酸钠胶粒的大小，可用培养液或0.15 mol/ NaCl漂洗胶粒。

6.  加入0.5 ml含有1%EDTA的0.9%NaCl溶液至0.5 ml 藻酸钠包埋的细胞中。

7.  EDTA能破坏Ca²⁺与藻酸的结合键，使胶转变成液体。

8.  台盼蓝测定肿瘤细胞。

9.  用50%的藻酸钠溶液稀释包埋细胞，以便在恒定体积内得到所需的肿瘤细胞数。

10.  用21号针沿腹白线皮下注射200 ul 藻酸钠溶液包埋的肿瘤细胞，以藻酸钠溶液作为对照。

11.  3~21天后，处死动物，从腹部皮下分离出藻酸盐胶粒：

（1）10%中性甲醛固定，石蜡包埋，切片，染色，进行组织化学和免疫化学检查。

（2）诸葛将其称重，于室温下载水中浸泡、摇动过夜，采用Drabkin分析方法在分光光度计540 nm 测定上清液中的血红蛋白含量。

（3）在处死动物前1 h，把⁵¹Cr标记的红细胞从尾静脉注射至小鼠体内。

（4）拉颈处死小鼠后，将分离出的藻酸钠胶粒和远离胶粒的一块组织称重，并用γ计数仪测定放射性。

血管生成机制复杂，参与并促进血管生成的因子也众多，EMT腹腔液中巨噬细胞数量明显增加，其分泌的TNF-α和IL-8可以促进血管内皮细胞的增殖，转化生长因子-β（TGF-β），血小板衍生内皮细胞生长因子(PD-ECGF)，乙酰肝素酶，血管生成素(angs)，骨生成素(OPN) ，环氧化酶(COX－2) ，缺氧诱导因子-1，层粘连蛋白(LN) ，胎盘生长因子(PLGF) ，Survivin，促红细胞生成素(Epo)均参与了EMT血管形成过程。

肿瘤血管生成是一个极其复杂的过程，一般包括包括血管内皮基质降解、内皮细胞移行、内皮细胞增殖、内皮细胞管道化分支形成血管环和形成新的基底膜等步骤。肿瘤血管生成的发生一方面是由于肿瘤细胞释放血管生成因子激活血管内皮细胞，促进内皮细胞的增殖和迁移，另外一方面也是因为内皮细胞旁分泌某些血管生长因子刺激肿瘤细胞的生长。肿瘤细胞和内皮细胞的相互作用自始至终贯穿于肿瘤血管生成的全过程。通常，肿瘤新生毛细血管是在原有的血管基础上延伸扩展而形成的，其过程类似于典型的伤口愈合和胚胎形成过程。这些新生血管为不断浸润生长的原发肿瘤提供营养，反过来，肿瘤细胞在生长过程中又分泌多种物质以加速肿瘤新生毛细血管的形成。