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        大鼠胰岛细胞培养实验

        相关实验:大鼠胰岛细胞培养实验

        最新修订时间:

        原理

        水合氯醛腹腔麻醉,采用胶原酶ⅴ逆行灌注、原位消化及Ficoll-400梯度离心的方法分离、纯化大鼠胰岛,并分离、培养胰岛单细胞。 

        材料与仪器

        步骤

        1. 一周龄Wistar大鼠,断颈处死,于75%乙醇浸泡15 分钟,无菌取出胰腺,于冰冷无菌D-Hanks’液中漂洗,用眼科剪仔细清除脂肪、包膜、血管等胰外组织,转入青霉素小瓶中。


        2. 加入少量无菌D-Hanks’液,用眼科剪剪成0.1-1.0 mm3 大小的碎片,用滴管轻轻吸出上层细小脂肪碎块和油滴,再用无菌D-Hanks’液反复清洗 8——10 次,加入10 倍体积无菌消化酶液[胰蛋白酶-胶原酶消化液: 0.05 g 胰蛋白酶,0.025 g Ⅴ型胶原酶(663 U/mg),0.05g葡萄糖,溶于100ml无 Ca2+、Mg2+的0.01 mol/L PBS(pH 值为 7.4)溶液,用0.22 µm 微孔滤膜滤菌],38℃±1℃消化,消化过程中不断震荡,10 分钟后弃去上清液。


        3. 用无菌D-Hanks’液将组织块清洗 2——3 次,加入新鲜酶液继续消化,重复上述步骤,此时组织块边缘模糊。


        4. 将组织块浸入消化酶液中,38℃±1℃消化10 分钟,将消化酶液与组织块分开,组织块重新加入新鲜消化酶液进行消化;而原消化酶液1500 rpm离心 10 分钟,取沉淀即为消化下的细胞,重新用无菌D-Hanks’悬浮,离心,重复 1——2 次,再用培养基洗 2——3 次,用培养基悬浮即得细胞悬液。


        5. 将消化过的组织块重复消化5——6 次至组织块消化完全,重复以上操作。


        6. 合并几次所得细胞悬液,计数,调整细胞浓度为 2×105个细胞/mL,将细胞悬液接种于24 孔塑料培养板中,每孔1 ml,置于37℃,5%CO2,饱和湿度培养箱中培养。


        7. 由于成纤维细胞贴壁要比胰岛细胞迅速,接种15 h 后,轻轻振荡培养板,将上面未贴壁的细胞接入新的培养板中,可除去部分成纤维细胞。


        8. 将新培养板中细胞培养 48 小时后,换新鲜配置的含有2.5 ng/mL 的碘乙酸的培养基培养5 h,可除去绝大部分成纤维细胞,而胰岛细胞不受伤害,换不含碘乙酸的培养基洗2次,并换不含碘乙酸的培养基在 37℃、5% CO2,饱和湿度培养箱中培养,每隔 3 天换培养液,获得单层胰岛细胞。


        注意事项

        1. 大鼠的胰岛提取一般胰尾含有量较多,一般提取时要注意以为部分,充盈良好与否很关键,对于提取量至关重要。


        2. 细胞培养过程中,请注意保持无菌操作。


        3. 传代培养过程中,胰酶消化时间不宜过长,否则会影响细胞贴壁及其生长状态。


        4. 培养基基于4℃条件下可保存3——6个月。

        来源:丁香实验

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