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        腺病毒介导EGFP基因转染神经干细胞

        相关实验:非整合型载体介导的基因导入技术

        最新修订时间:

        原理

        腺病毒是一种大分子(36 kb)双链无包膜DNA病毒。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内,然后腺病毒基因组转移至细胞核内,保持在染色体外,不整合进入宿主细胞基因组中。


        本实验从新生SD大鼠海马组织中分离神经干细胞,并通过观察携带EGFP基因的腺病毒(Ad/ EGFP)转染NSCS后EGFP表达规律及转染对NSCS的活力、增殖、分化等的影响,探讨EGFP作为NSCS的示踪标志物的可行性,为进一步的NSCS移植研究提供体外研究基础。

        材料与仪器

        步骤

        一、NSCS的分离、培养及鉴定


        取新生大鼠置于0.5%碘伏中消毒,取脑,分离海马,剥离脑膜血管,将海马组织移入含有2%B27的高糖DMEM/F12培养液中,尽量将组织剪碎,轻轻吹打制成细胞悬液,400目筛网过滤,台盼蓝染色,细胞计数,以2×106个/L接种到6孔培养板内,最后加入EGF(终浓度20 μg/L)和bFGF(终浓度20 μg/L),置37℃、5% CO2平衡湿度培养箱中。每2——3天半量换液1次,每7——10天传代1次。对第3代培养7天的细胞球用Nestin免疫荧光染色法进行鉴定,荧光倒置相差显微镜观察拍照。


        二、Ad/EGFP转染NSCS


        把第3代培养7天的细胞按2×105个/孔接种到24孔板,每孔加入DMEM/F12+EGF+bFGF培养液1 ml,转染前1天半量换液。实验分为5组,感染复数(multiplicity of infection,MOI)分别为0∶1(对照组)、10∶1、20∶1、50∶1、100∶1,每组设8孔。根据感染复数计算加入所需腺病毒悬液的体积数,在EP管中将所需的腺病毒悬液与无血清的DMEM/F12培养液混合,将混合液按照分组分别加入到每组细胞中,每孔0.2 ml。将24孔板置于37℃、5%CO2培养箱中培养,4 h后用DMEM/F12清洗细胞2次,弃病毒残液。每8 h观察EGFP的表达情况,常规半量换液。转染后48 h,在200倍荧光显微镜下,随机选取5个视野,分别计算绿色荧光阳性细胞百分数,用以代表Ad/EGFP对NSCS的转染效率。


        三、Ad/EGFP体外转染对神经干细胞增殖的影响


        各组分别在第7天、第14天、第21天细胞传代时各取100 μl,用台盼蓝染色并计算细胞活力,计算公式为 :细胞活力(%) = (细胞总数-死亡细胞数)/细胞总数×100%。并在100倍显微镜下,各组选取培养板4角的4个区域及中央1个区域进行神经干细胞球的计数。用Nestin荧光免疫细胞化学染色法对培养的细胞球进行鉴定。


        四、Ad/EGFP体外转染对神经干细胞分化的影响


        对照组和转染组的神经干细胞球在培养第7天时用10%FBS诱导分化,在第14天行免疫细胞化学反应。每组任选3孔,每孔随机选择5个视野,相差显微镜下400倍视野计算细胞总数、β-Ⅲ tubulin和GFAP阳性细胞数,同时计算阳性细胞数占细胞总数的百分比;藉此区分神经元、星形胶质细胞,以鉴定转染Ad/EGFP的NSCS的多分化潜能。


        五、统计学处理


        计量资料以x±s表示,用单因素方差分析及两两比较检验;计数资料应用χ2检验。数据应用SPSS10.0进行统计学处理。检验水准:α=0.05 。

        来源:丁香实验

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