• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        机械法

        最新修订时间:

        原理

        这是一种快速简便提取植物总DNA的方法。先将新鲜的叶片在液氮中研磨,以机械力破碎细胞壁,然后加入十六烷三甲基溴化铵分离缓冲液,使细胞膜破裂。同时将核酸与植物多糖等杂质分开(十六烷三甲基溴化铵,简称CTAB,是一种阳离子去污剂),再经氯仿-异戊醇抽提去除蛋白,即可得到适合于酶切的DNA。

        材料与仪器

        步骤

        一、实验试剂及材料
         
        1.  材料:幼嫩的植物材料0.5g左右。
         
        2.  试剂:液氮,CTAB抽提缓冲液:2%CTAB(cetyl trimethyl ammonium bromide, 十六烷基三甲基溴化铵),1%β-巯基乙醇 1.4mol/L Nacl,20mmol/L EDTA,100mmol/L Tris-Hcl pH8.0,3M NaAC,50mM Tris-HCl pH8.0,20mM EDTA,氯仿:异戊醇(24:1),异丙醇 ,70%乙醇,TE buffer。
         
        二、实验方法
         
        1.  取0.5 g植物材料,双蒸水洗净,并用滤纸吸干。
         
        2.  植物材料剪成1 cm左右碎片,放入预冷的瓷研钵中。
         
        3.  加入液氮速冷,研磨成细粉(越细越好)。
         
        4.  在5 ml离心管中加入抽提缓冲液2.5 mll,60℃保温1小时。
         
        5.  15 000 rpm,离心10分钟。上清转入另一个新的离心管中。
         
        6.  加入等体积氯仿:异戊醇(24:1),混匀抽提至水乳胶融状。
         
        7. 15 000 rpm,离心10分钟。
         
        8.  上清转入另一个新的离心管中。
         
        9.  加入2/3倍体积预冷异丙醇,-20℃保温30 min-1 h,缓缓混匀DNA成絮状折出。
         
        10.  15 000 rpm,离心10分钟,弃上清。
         
        11.  DNA沉淀用 70%乙醇洗2次。
         
        12.  加入400 ul TE buffer溶解DNA。
         

        注意事项

        真核细胞基因组较大,在操作中应注意动作轻柔,且在低温下进行,以最大限度地减少机械和化学作用对DNA的剪切,从而获得相对完整的DNA。

        常见问题

        以下几点可能会有所帮助: 1. 坚持使用2-巯基乙醇和PVP; 2. 取幼嫩一点的材料; 3. 低温; 4. 快速; 5. 酚氯仿抽提离心后, 小心吸取上清液, 求质量而不求数量; 6. 压轴的一点技巧, 酚氯仿抽提时尽可能充分混匀。

        来源:丁香实验

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序