病毒免疫荧光实验

1.病毒染色标本的制备 2.荧光抗体的制备 3.​荧光素标记抗体 4.荧光抗体染色

步骤1： （一）病毒染色标本的制备 标本的制作要求维持完整的抗原成分，细胞形态学变化尽可能小，抗原所在位置尽可能不变，不溶解扩散，不脱落。 （二）固定病毒标本所选用的固定剂应以既具有改变细胞膜的通透性使荧光抗体通过细胞膜与细胞内抗原结合又不破坏病毒的抗原性为原则，通常采用冷丙酮。 （三）标本在固定前一定要彻底吹干，否则在以后的操作步骤中，标本易脱落。 （四）冲洗时应使水流到标本上方，再流经标本，防止标本从玻片上脱落。 步骤4：（一）对荧光抗体的稀释度应适当，过浓易出现非特异性染色，过稀会降低特异荧光亮度，甚至出现假阴性。 （二）已知抗原标本片需在操作的各个步骤中始终保持湿润，避免干燥。 （三）所滴加的待检抗体标本或荧光标记物，应始终保持在已知抗原标本片上，避免因放置不平使液体流失，从而造成非特异性荧光染色。 （四）染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min到数小时，一般 30 min 已足够。 （五）封片时应防止产生气泡。 （六）荧光染色后一般在1h 内完成观察或于 4℃保存 4 h,时间过长会使荧光减弱。 （七）为排除非特异性荧光，试验时必须设置以下对照： 1. 直接法： (1) 标本自发荧光对照：标本只加入 PBS 应无自发荧光； (2) 阻断试验：标本先加未标记特异性抗体，再加标记荧光抗体，结果应为阴性； (3) 阳性对照：用已知阳性抗原作荧光染色，应呈阳性。 2. 间接法 心标本自发荧光对照；(1)荧光抗体对照：标本只加荧光抗体染色，结果应为阴性；(2)阻断试验：先加第一抗体，再加未标记的第二抗体，最后加标记的第二抗体，结果应为阴性；(3)阳性对照：用已知特异性抗体与相应抗原结合，再加荧光抗体，结果应为阳性；(4)阴性对照：用已知阴性材料代替第一抗体，经荧光染色后应为阴性。以上结果完全正确，正式实验才能确定结果。此后每批实验都设阴性和阳性对照，以确保实验的准确性。 3. 补体法：除设有阴性、阳性对照外，还应设不加补体的对照，不加抗血清的对照。