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        用非同位素探针进行原位杂交和检测实验

        实验分类:

        生物化学实验

        最新修订时间:

        简介

        非同位素原位杂交技术可用于测定细胞和组织中特异性转录物定位及其表达的相对 水平。它是用一标记生物素或地高辛的非放射性探针和所制备样本中的RNA进行杂交,非同位素探针通常通过荧光或酶法予以检测。来源:《精编分子生物学实验指南》第五版

        来源:丁香实验

        操作方法

        荧光原位杂交

        1a)石蜡切片或细胞的杂交,对载玻片进行脱蜡、水化、 封闭和脱水处理。将标本晾干(或在干燥器中干燥),随后储于加有干燥剂的载玻片盒中,置-70℃过夜。至关重要的是标本在储放前应绝对干燥。1b)冰冻切片的杂交:进行切片的预处理和乙酰化处 理,随后进行切片的脱水。标本绝对干燥至关重要,此时切片即可用于杂交(步骤3)。杂交应马上进行。2) 对每一杂交实验,可用乙醇沉淀10〜15 ng探针,重溶于10μL

        杂交信号的放大

        1) 用生物素酰化探针与切片进行杂交、洗涤,进行第一轮杂交信号检测。对生物素酰化探针信号的放大,可在基本方案步骤8之后的任何一步进行。2) 如果切片已加盖玻片并密封,可用一针头或解剖刀片划开密封的指甲油,移去盖玻片,并除去载玻片上指甲油。将玻片浸于盛有 0.1% Triton ×-100/4×SSC的,以铝箔包裹的Coplin广口瓶15 min,轻轻摇动。如盖玻片不易松动,应小心抬起,重复洗涤2次

        地高辛标记探针的信号放大

        1) 用地高辛标记的探针与切片杂交并洗片。2) 加50μL 10 /ng/ml的羊抗地高辛抗体Fab片段于玻片上,盖以22 mm2大小的Para- film 膜,置 37℃温育 30 min。3) 移去Parafilm 膜,分别在 4×SSC、0.1 % Triton×-100/4 ×SSC、4×SSC 中洗片, 每次15 min。4) 吸去残余4×SSC,加50μL地高辛信号放大溶液于玻片上,盖

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