序列特异性 DNA 结合蛋白的亲和层析纯化实验

1) 在1个1.5 mL的微量离心管中准备下面物质的混合物：含有每种寡核苷酸440μg的TE缓冲液，总体积为130μL。再加入20μL 10×T4噬菌体多核苷酸激酶缓冲液。88℃温育2 min, 65℃10 min, 37℃10 min,室温 5 min。2) 将上述混合物平均分入2个微量离心管中。每管（75μL)加15μL 20 mmol/L ATP (pH 7.0)、约 5μ Ci [γ-32

1) 制备标记的被连接的寡核苷酸探针2) 称出3 g溴化氰活化的Sepharose 4B (1 g冻干树脂可得到终体积约3. 5 mL的凝胶体积)。3) 将干树脂置于一个15 mL的锥形聚丙烯管中。用10 mL lmmol/L盐酸水化树脂，弹击及来回颠倒管子以轻轻混匀。1 min后，将浆状树脂移入一个60 mL粗烧结玻璃漏斗中，缓缓倒入500 mL 1 mmol/L盐酸流过漏斗以洗涤和溶胀树脂（这

1) 制备一块20cm×40 cm×1.5 mm的变性胶，带有4个样品孔，孔宽为3 cm。对于分离约10〜45个碱基长的寡核苷酸，用16%的聚丙烯酰胺/尿素胶（对于更长的寡核苷酸用8%或6%的聚丙烯酰胺/尿素胶）。让胶聚合30 min以上，然后30 W预电泳 >1 h。2) 将各寡核苷酸溶于甲酰胺加样缓冲液中至终体积200μL , 65℃加热15 min以去除 DNA 二级结构。各孔中分别加

1) 一次性层析柱中1 mL床体积的DNA亲和树脂，用10 mL缓冲液Z/0. 1 mol/L KCl 洗涤2次，进行柱平衡。2) 在缓冲液Z/0.1 md/L KCl中将部分纯化的蛋白质组分与非特异性的竞争DNA (由DNA结合研究确定）结合。3) 将混合物在冰上孵育10 min。4) 12 000 g，4℃离心10 min，以沉淀不溶性的蛋白质-DNA复合物。5) 上清在重力作用下加于柱上（如