利用模块装配方法构建锌指核酸酶以位点特异的方式操作基因组实验

实验分类：

其他实验

最新修订时间：2022-02-10

简介

同源重组是基因组操作中最精确的一种方法。作为一个工具，同源重组已经广泛地用于细菌、酵母、鼠胚胎干细胞（E S ) , 以及其他一些特殊细胞系，但在其他系统如哺乳动物体细胞遗传学上还没有得到应用。最近的研究工作表明，在哺乳动物体细胞中，双链 D N A 发生基因特异的断裂，能够引起上千倍的同源重组。目前，利用锌指核酸酶(Z F N )，能够在哺乳动物基因组中形成这种双链断裂。 Z F N 是一种人工蛋白质，由一个铸指D N A 结合结构域与一个非特异性的核酸酶结构域融合而成。本章描述如何鉴定Z F N 切割的潜在靶向，如何使 Z F N 切割该靶向位点，以及测定这些新设计的Z F N 在培养的哺乳动物细胞系统中是否有活性。
作者：T.弗里德曼等,译者：殷勤伟等，本实验来自「基因转移」

来源：丁香实验

操作方法

利用模块装配方法构建 ZFN

利用模块装配方法构建 ZFN 材料试剂琼脂糖凝胶（2.5%) 牛小肠碱性磷酸酯酶 d N T P (每种10 mmol/L ) 转化用大肠杆菌 MgCl2 (50mmol/L ) 质粒： pBluescript (p B S --Z F ) 和 p c D N A 6 (Invitrogen) P C R 片段纯化试剂盒 10 X 聚合酶缓冲液

利用 GFP 报道系统测定新三指 ZFN

利用 GFP 报道系统测定新三指 ZFN 材料试剂转化用大肠杆菌 F A C S 缓冲液磷酸盐缓冲液（P B S ) 2 % 小牛血清 1 mmol / L E D T A 0.1 % 叠氮化钠 G 4 1 8 H E K -293 细胞 M A C S 缓冲液 P B S 2 % 小牛血清 1 mmol / L E D T A