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        细胞破碎和蛋白质溶解实验

        实验分类:

        蛋白质实验

        最新修订时间:

        简介

        为了纯化细胞蛋白质,采用有效的方法进行细胞破碎和固液分离是必要的。它是全过程的第一步,通常是将处于细胞不同位置的待纯化蛋白释放出来,溶入已知成分的溶液内。该步骤是目的蛋白初级分离纯化阶段的重要环节,它直接影响产物的回收率,也可能影响产物的纯度。


        来源:《蛋白质技术手册》

        来源:丁香实验

        操作方法

        匀浆法

        1. 用组织剪或芋术刀迅速将清洗的组织分离成适宜的小块,如 1 cm3;2. 每体积湿重组织通常加 3~5 倍体积预冷的匀浆缓冲液至匀浆容器内;3. 制备匀浆 :3.1 电力驱动的玻璃匀浆器以 500~1500 r/min 的速度,匀浆 3~6 次,每次 5~10 s 。3.2 手动玻璃匀浆器匀浆 10 ~20 次。3.3 刀片式组织破碎匀浆器和内切式组织匀浆器以 1000~3000 r/min

        ​超声法

        1. 清洗后的组织用搅切机切碎成小块,混悬在至少两倍体积的缓冲液内;洗去培养液的细胞(细菌混悬在至少两倍体积的缓冲液内;2. 将超声探头没入混悬液内,进行超声破碎。一般总超声时间约分为几个周期,如 4 × 30 s, 周期之间让样品在冰浴中冷却。

        高压匀浆法

        1. 用裂解缓冲液混悬清洗过的细胞。通常细胞湿重(g )与缓冲液体积(ml)之比的范围是 1/1 到 1/4; 2. 加样品液进入高压室,并提升压力至预定值(一般 0.55×108~1.38×108 Pa); 3. 维持上述压力,调整出口流速为每分钟 2~3 ml(约每秒 1 滴)。

        研磨法

        1. 加 20 g 淸洗过的细胞入预冷的研钵内;2. 准备 40 g 石英沙或氧化 铝;3. 在研磨细胞的过程中逐步加入石英沙或氧化铝,即边研磨边加入。加完磨料再继续研磨几分钟;4. 用 60 ml 缓冲液混悬细胞糊,离心除去细胞碎片和磨料。

        (高速)珠磨法

        1. 0.1~3 g 湿重细胞混悬在等体积缓冲液内。容器建议选用结实的聚乙烯试管;2. 每克湿重细胞加入 1~3 g 预冷的玻璃珠;3. 用混旋搅拌器最大强度混旋 3~5 次,每次 1 min, 两次之间置冰上冷却 1 min。

        酶溶法

        1. 混悬洗过的大肠杆菌于 TE 缓冲液内,每克细菌需 3 ml 缓冲液。调整温度至 20℃~37℃;2. 每 5 ml 混悬液加入1 mg 溶菌酶,可以从新配制 10 mg/ml 的母液吸取或直接用酶的冻干粉;3. 在 20℃~37℃ 温育 10~20 min,同时轻轻摇动。

        化学渗透法

        1. 用缓冲盐液(TBS:10 mmol/L pH7.5 Tris-HCl,150 mmol/L NaCl) 4℃:洗细胞几次;2. 离心除去缓冲盐液,在 含 0.1 %~0.3 % Triton X-100 的缓冲盐液(TBS) 中混悬细胞(107~ 108 细胞/ml 或总蛋白 3 ~ 4 mg/ml);3. 混旋或颠倒试管几次后,冰浴中孵育 10 ~60 min。

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