固相 pH 梯度等电聚焦实验

1. 选择 pH 范围，计算缓冲与滴定 Immobiline 的体积 对未知样品 pH 范围的选择，最好先用宽范围（如 pH 3.5~10 ) 载体两性电解质等电聚焦确定其等电点的位置，再选择窄范围的固相 pH 梯度等电聚焦。确定范围后，根据表 7.4 和 7.5 査得或进一步用内插法计算得到缓冲和滴定 Immobiline 的体积。 2. 贮液配置 丙烯酰胺单体贮液：溶解 14

打开循环水浴，设置冷却温度，一般为 10℃。 将制好的固相 pH 梯度凝胶铺在冷却板上，注意正负极。其间涂以液体石蜡或煤油，避免气泡陷入，以保证胶板和冷却板之间的良好接触。 用合适的电极溶液（参见表 7.7) 润湿滤纸电极条，分别放置凝胶的酸、碱侧。有的仪器采用粗电极与凝胶直接接触，不需加电极条。 按冷却板上的格子和预先设计的实验计划将样品加在凝胶上。微量样品可直接滴加，稀样品加在滤纸块

由于固相 pH 梯度凝胶的导电性很低，不可能用表面电极测定凝胶表面的 pH。但对于宽范围的固相 pH 梯度可以用等电点蛋白标准来测定，方法同载体两性电解质等电聚焦。但目前还没有合适的市售蛋白标准可用于测定窄范围的固相 pH 梯度。灌制凝胶时，pH 梯度范围是已知的，且梯度是线性的。故可根据凝胶两端之间距离来测算 pH 梯度和蛋白质的 pI。在灌制非线性梯度胶时，则可根据非线性梯度来计算。

1. 各种染色方法 在所述的染色方法，包括各种考马斯亮蓝方法、银染色、荧光探针法、放射自显影、免疫固定等均适用于固相 pH 梯度等电聚焦后的检测。 作者实验室进行转铁蛋白的考马斯亮蓝 R-250 染色时，脱色困难。用 G-250 染色时，脱色同样困难。为了提高脱色效率，改进了脱色液的配方，调整了染色和脱色时的温度和时间。 2. 凝胶干燥与保存 请参阅 “常规聚丙烯敢胺凝胶电泳”。 3.