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        双向电泳操作步骤

        实验分类:

        蛋白质实验

        最新修订时间:

        简介

        双向电泳可应用于蛋白质组学研究。

        来源:丁香实验

        操作方法

        双向电泳操作步骤

        一、样品制备。1. 称重后将样品加入Dounch匀浆器。每100 mg 组织加入1.5——2.0 ml SDS/或尿素/溶解缓冲液,用B号研棒冲击50次,然后以A号研棒冲击50次。2. 放置几分钟后,取一小份样品于200 μl 离心管100 000 g 离心2 h 以上或在200 000 g 以上离心1 h。保留上清(蛋白样品)。加样于第1向凝胶上。二、第一向等电聚焦。1. 在干净的1.5 mm

        第一向凝胶

        1. 在干净的1.5 mm 内径的凝胶柱管上作好标记以指示应灌制凝胶柱的髙度。用橡皮筋将凝胶柱管捆绑成束,在一水平面上垂直竖起管束,从其顶部向下推压,使各柱管的底部平齐。 2. 用三、四层Parafilm膜小心封好2.5~3.0 cm 内径的凝胶灌制管的一端,使之形成一个结实的水密性的密封面。 3. 将凝胶柱管束放入凝校灌制管内,用环形支架和夹子将灌制管固定在垂直的位置,并使其密封端置于一水

        第二向凝胶

        1. 用垫片组装凝胶平板。夹层每边的垫片之上用夹子固定,并置于凝胶支架上。注意玻璃平板和垫片的平齐,收紧夹子以保证密封圈不发生泄漏。调整平板的水平和垂直,在平板间将放上凝胶识别标签,使之留在右下角。 2. 在一个真空瓶中分别加入30%丙烯酰胺/0.8%亚甲双丙烯酰胺,凝胶缓冲液和水,配制凝胶溶液。真空下脱气5 min。 3. 加入10%SDS和TEMED,摇匀;再加入10%过硫酸铵,摇匀。

        组织来源的蛋白质样品的溶解和制备

        1. 称重后将样品加入Dounch匀浆器。每100 mg 组织加入1.5~2.0 ml SDS/或尿素/溶解缓冲液,用B号研棒冲击50次,然后以A号研棒冲击50次。 2. 放置几分钟后,取一小份样品于200 ul 离心管100 000 g 离心2 h 以上或在200 000 g 以上离心1 h。保留上清(蛋白样品)。加样于第1向凝胶上。

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