RNA 实验

用哺乳动物细胞 S10 抽提物翻译脊髓灰质炎病毒和丙型肝炎病毒 mRNA 的技术。

TNT 耦联网织红细胞裂解物系统乂可以分为：TNTT7 系统、TNTSP6 系统和 TN 下 PCR 系统。其屮，TNTT7 系统可以从线状和环状 DNA 中翻译蛋白质，SP6 系统只能使用环状 DNA 进行翻译，而 PCR 模板可使用 TNTPCR 系统迸行翻译。

S30 提取物系列产品共分为三类：适用于对环状 DNA 进行体外翻译的大肠杆菌 S30 提取物系统、适用于对线状 DNA 进行体外翻译的大肠杆菌 S30 提取物系统和适用于对环状 DNA 进行休外翻译的大肠杆菌 T7S30 提取物系统。

非洲爪蟾卵母细胞体外翻译系统由于具有转移定位、信号肽的切除和糖篇化的能力，因此对于绝大多数的外源性 mRNA 都具冇持续性的修饰加工能力。由于其膜的稳定性高，因此可使用蔗糖密度梯度离心或蛋白酶保护反应等方法分析转录产物的定位。

麦胚提取物体外翻译系统可用于病毒和真核细胞中 mRNA 在异种无细胞体系中的有效的翻译

从哺乳动物细胞中提取的 mRNA 或通过克隆化 DNA 在体外转录产生的 mRNA 在无细胞提取液中能被翻译而合成蛋白质,这些蛋白质可用于免疫沉淀试验或进行生物学活性测定。

体外实验有两种策略；一是将 包 含 Po ly( A) 位点目标基因的质粒与无细胞提取物共同孵育，以 使 RNA 聚 合 酶 II 转录目标基因，并对最初的转录进行加工；另一种策略是利用标准的噬菌体聚合酶驱动系统合 成 前 mRNA，然后与无细胞提取物共同孵 育 。

脱氧核酶是一类由三十几个脱氧核苷酸构成的寡聚脱氧核糖核苷酸，制备容易，使用方便，是体外在特定位点切割 RNA 的有效方法。常用于体外切割 RNA 底物的脱氧核酶是「10~23」型脱氧核酶。

核酶是获得长片段 RNA 特定位点切割产物的有用工具，可用于研究 RNA 修饰，修饰位点分析，以及获得具布不间长度末端的 RNA 转录产物。

T4RNA 连接酶已经用来生成很多位点特异修饰的 RNA，尤其是寡核苷酸修饰和用反义密码 tRNA 修饰的 RNA。另外，T4RNA 连接酶还可用于 RNA/DNA 分子内/分子间连接、甲链寡脱氧核苷酸的连接、克隆全长 cDNA 及将非天然氨基酸掺入蛋白分子中。

T4 DNA 连接酶可将双链复合物缺刻连接，其中包括 RNA-DNA 杂合链及 RNA-RNA 杂合链。

利用 RNA 模板通过反转录获得 DNA,进而复制和感染细胞

转录过程中的 RNA 分子内标记，转录后利用 T4 多核苷酸激酶的 RNA5＇端标记和利用 T4RNA 连接酶的 RNA3＇端标记。

核转录 (runoff) 分析可以用于检测分离细胞核中特定基因的转录效率。进行核转录失控分析时，在体外将细胞核分离出来，然后在放射性同位素标记的核苷酸存在下进行转录，所合成的 KNA 均因掺入同位素而被标记，此混合 RNA 与固定在硝酸纤维素滤膜 h 的某一特定甚因的 DNA 探针杂交，就可以反映出该基因的转录狀态和转录速率。

在 2 个 5'端的核苷酸进行核糖基 C2＇-甲氧基修饰。用修饰过的引物 PCR 扩增得到的 DNA 仍可降低 N+l 活性，由于 PCR 可以产生几个 kb 的长模板，因此可以制备少异质性的 RNA

一些 RNA 转录物要求其 5＇末端有 m7 G(5＇)Ppp(5＇）G 帽子，它们在无细胞抽提物或在非洲爪蟾卵母细胞中才具有较高的翻译效率。也有报道表明具有甲基化帽子的转录物在体外剪切时具有较高的效率，并对核抽提物中的核酸酶具有更大的抗性

RNA 实验技术手册（分子克隆-实验指南系列）

利用 SDS 裂解细胞 ，并用酸性苯酚分级提取细胞总 RNA, 这是一种适合于处理 mRNA 含量相对较低、内源性 RNase 活性较髙的细胞的方法，该方法 RNA 损失极少，简便易行 ，可同时处理多个样品。对大多数细胞株来说，在一个直径 90mm 培养皿中培养细胞 ，其 RNA 收率为 100〜200ug。

大鼠肝经匀浆，离心取上清液，用苯酚、m-甲酚混合液提取 RNA。在萘 1,5-二磺酸的存在下，可使 rRNA 与 mRNA 等分离，得到纯 rRNA

从病理科取来的经福尔马林固定、石蜡包埋的组织可用于RNA 表达分析.常规固定和石蜡包埋后，从活组织、手术、尸体组织中分离出来的 RNA 并不完全降解.并且即使在切除后未立即固定,富含 RNase 的器宫如胰腺内仍存在大约 100 个碱基或更长的 RNA碎片。下面介绍一种从 6〜8 um 组织切片中提取RNA 的方法。