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        DNA 片段的回收实验

        实验分类:

        DNA 实验

        最新修订时间:

        简介

        目的DNA片段的回收技术是重组DNA中的关键技术,回收是指从电泳介质中纯化出目的片断。

        来源:丁香实验

        操作方法

        树脂回收法

        一、从琼脂糖介质中纯化DNA片断 1. 用低熔点或常规熔点琼脂糖电泳对PCR扩增片断进行分离,该电泳安常规方法进行,缓冲液为TAE。 2. 在凝胶上,找到所需条带,然后用洁净并灭菌的小刀将其切下接近300微升琼脂糖凝胶 (约300毫克) 3. 如果切下的琼脂糖为高融点的则安下面A步骤进行,如为低融点琼脂,则安B步骤进行。 A. 将300微升琼脂块放进1.5毫升的

        微量柱法

        1. 紫外灯下从胶上切下目的片段,放入一Epphendof管中。 2. 离心管在-20℃冷却5~10分钟。 3. 将微量柱下套上一Epphendof管,将冷却的胶条装进微量柱中,4℃12 000 rpm 离心10分钟。 4. 弃微量柱,用酚/氯仿、氯仿抽提Epphendof管中液体各一次。 5. 1/10体积乙酸钠+2体积无水乙醇沉淀2小时。 6. 70%乙醇洗沉淀,真空干燥,复溶于dd

        液氮冻融法

        1. 紫外灯下从胶上切下目的片段,放入一Epphendof管中。 2. 离心1 min,加入500 ul TE,200 ul 酚/氯仿混匀。 3. 离心管放入液氮中10~15 min,再室温放置,反复冻融。 4. 用酚/氯仿、氯仿抽提Epphendof管中液体各一次。 5. 1/10体积乙酸钠+2体积无水乙醇沉淀2小时。 6. 70%乙醇洗沉淀,真空干燥,复溶于dd水或TE中。

        常规方法

        1. PAGE电泳,如EB染色的则在紫外灯下切下目的片断,如龈染或其他非放染色的则在关下切下目的片断。 2. 用少量脱缓冲液I将目的片断胶条洗至一Eppendorf管中,用玻棒将凝胶捣碎,用150 ul 洗脱缓冲液II将玻棒上的凝胶洗至Eppendorf管中。 3. 振荡后置于37℃3~5小时或过夜。 4. 振荡后离心(10 000 g,10 min),取上清液,并再用200 ul 洗脱缓冲

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