DNA 实验

体外基因突变技术分随机突变（random mutagenesis）和定点突变（site-directed mutagenesis）两类。随机突变常用于鉴定靶基因的某项特定功能在基因序列中所处的大致位置及其与周围序列的关系。对靶基因产物及其功能知之甚少时，可首先采用随机突变法确定其功能区域。目前，体外基因随机突变常用化学诱变法（chemical mutagenesis）和易错 PCR法（error-

核酸分子杂交（nucleic acid hybridization）技术是分子生物学领域中最常用的基本技术方法之一。核酸分子杂交依据被分析样品的性质不同可以分为液相杂交与固相杂交两种。固相杂交是将参加反应的一条核酸单链先固定在固体支持物上，另一条互补核酸单链游离在溶液中，两者在一定的条件下进行杂交反应。固体支持物有硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，

当前利用模式小鼠研究基因功能主要有两个策略：基因驱动法（gene-driven approach）和表型驱动法（phenotype-driven approach）。基因敲除是典型的基因驱动法，采用此法产生一个基因敲除小鼠大约需要 1 年半的时间，而且只能对已知序列的基因进行操作，不能适应现代生物学高效率、高通量的需要。表型驱动法是指利用化学试剂在较短时间内诱导动物产生大量随机突变表型，或者通过转

当前利用模式小鼠研究基因功能主要有两个策略：基因驱动法（gene-driven approach）和表型驱动法（phenotype-driven approach）。基因敲除是典型的基因驱动法，采用此法产生一个基因敲除小鼠大约需要 1 年半的时间，而且只能对已知序列的基因进行操作，不能适应现代生物学高效率、高通量的需要。表型驱动法是指利用化学试剂在较短时间内诱导动物产生大量随机突变表型，或者通过转

焦磷酸测序 (pyrosequencing) 是一种基于发光法测定焦磷酸 (PPi) 的测序技术。焦磷酸测序技术的三个关键点分别是：①反应中使用 dATP 的类似物 dATPaS，因为 dATP 的结构与 ATP 相似，能与荧光素反应发出荧光，而 dATPαS 几乎不产生背景荧光。②反应中三磷酸腺苷双磷酸酶使测序能循环进行，因为每加一种 dNTP 时必须除去上一次未反应的 dNTP，否则会影响连续

目前，自动激光荧光 DNA 测序技术（又称第一代测序技术）的应用已十分普遍。自动激光荧光DNA测序的基本原理均基于Sanger双脱氧法，但不同的自动激光荧光DNA测序系统的具体工作原理却不尽相同，概括起来，可将工作原理分为四色荧光法和单色荧光法两类。

DNA 体外重组，又称基因克隆，是基因操作中最基本的技术，也是分子生物学的核心技术。DNA 重组技术，是指应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的 DNA）与载体 DNA 接合成一具有自我复制能力的 DNA 分子-复制子（replicon），继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一 DNA 分子，其基本

RNA 样品经甲酰胺处理以及经含有甲醛的凝胶电泳分离可能会发生变性，这一方法是从 Lehrachetal. (1977), Goldberg (1980)，Seed (1982a）和 Rosen et al, (1990) 修改而来。RNA 在含有 2.2 mol/L 甲醛的凝胶上电泳分离。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。

限制性核酸内切酶消化DNA实验可以用于（1）核酸内切酶大多数来自于细菌体内,与相伴存在的甲基化酶共同构成细菌的限制-修饰体系, 限制外源DNA、保护内源DNA。（2）将酶切后的片段连接到载体上。

DNA电泳可用于：（1）分离不同大小的DNA片段；（2）鉴定目的DNA片段；（3）纯化和回收DNA片段。

如果提取的痘苗病毒DNA用于转染，则应在蛋白酶 K 消化和苯酚抽提后分离。具体方法见本实验。来源《精编分子生物学实验指南（第五版）》

除了 PCR 和 Southern 杂交可以检测病毒 DNA 外，也可以利用 DNA 点迹杂交方法检测在分离的噬斑中的重组病毒。本实验主要介绍用这3种方法来检测痘苗DNA。内容来源《精编分子生物学实验指南（第五版）》

本节介绍依赖于在哺乳动物细胞质合成噬菌体T7 RNA聚合酶的瞬时细胞质表达系统。首先，将感兴趣的基因插入质粒中，使其位于T7 RNA聚合酶启动子（PT7）的控制下。在培养过程中，外源基因被高效的 T7 RNA聚合酶转录。这种转染方案适用于分析的目的，因为不需要构建新的重组病毒，所以比较简单。对于大规模的工作，PT7 操纵的基因可以通过同源重组插入另一个重组痘苗病毒中，使之与 vTF7-3 共同感染

本实验中我们有两个目标：首先是分离 ras2 缺失突变的典型抑制基因，我们将要测定究竟抑制基因是显性的还是隐性的以及在隐性抑制基因中有代表性的互补组的数量；其次，我们将分离髙拷贝抑制基因和这些菌株中的质粒，确定引起抑制的质粒，经测序确定高拷贝质粒携带的基因。

PCR被用于从每样品的1〜20 000个分子中定量某一特定DNA序列的 数量。此外，它可辅助评估那些造成这类实验失败的污染序列的存在。来源：《精编分子生物学实验指南》第五版

本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。

本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。

在合成过程中，低浓度的放射性标记的 dNTP 使探针的长度限制为 200~300 个核苷酸。但是新合成的 DNA 可通过改变投入的模板量和 dNTP 的浓度使其长度为 100~1000 个核苷酸，如此长度范围内的探针适用于大多数杂交实验。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。

研究染色体水平的 DNA 损伤是遗传毒理学的重要组成部分，因为染色体突变是癌症发生过程中重要的一环。微 核 实 验（micronucIeus assay) 因为能准确检测染色体丢失和染色体断裂而被认为是评价染色体损伤的最佳方法之一。由于微核只出现在完成细胞核分裂的细胞中，可使用一种微丝聚合抑制剂松胞菌素 B (cytochalasinB ) 阻止胞质分 裂（cytokinesis) 的方法从而根据

本方案以 poly(A) + RNA 作为模板，通过随机引物反应合成 cDNA 探针，这类探针可用于 cDNA 文库的差异筛选。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。