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- XK-SJH-A778
- 国产
- 2025年07月15日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 库存：
100
- 英文名：
Ribulose diphosphate carboxylase/oxygenase (Rubisco) test kit
- CAS号：
无
- 保质期：
1年
- 供应商：
上海晅科生物科技有限公司
- 保存条件：
2-8℃
- 规格：
100管/96样
二磷酸核酮糖羧化酶（Rubisco）试剂盒说明书
微量法 100 管/96 样
正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：
二磷酸核酮糖羧化酶（EC 4.1.1.39）是植物光合作用中的一个关键酶，既控制着CO2的固定， 同时又制约着碳素向Calvin循环和光呼吸循环分流，其活性的大小直接影响着光合速率。 测定原理：在 Rubisco 的催化下，1 分子的核酮糖-1，5-二磷酸（RuBP）与 1 分子的 CO2 结合，产生 2
分子的 3-磷酸甘油酸（PGA），PGA 可通过外加的 3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶的作用，产生甘油醛-3-磷酸，并使还原型辅酶 I（NADH）氧化。因此，340nm 吸光度的变化可计算还原型辅酶 I 氧化速率，还原型辅酶 I 氧化速率可反应 Rubisco 的活性。
需自备的仪器和用品：
分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。试剂的组成和配制：
提取液一：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。提取液二：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。试剂一：25mL×1 瓶，4℃保存；
试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前加入 10mL 试剂一，充分混匀待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前加入 10mL 试剂一，充分混匀待用；用不完的试剂
分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
试剂四：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前加入 1 mL 试剂一，充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
（注意：试剂二、三、四溶解后，按需分装-20℃保存。）
粗酶液制备：
①总 Rubisco 酶提取：建议称取约 0.1g 样本，加入 1mL 提取液一，冰浴匀浆后超声破碎（冰浴，200W，破碎 3s，间歇 7s，总时间 1min），然后 4℃，8000g 离心 10min，取上清测定。②胞浆和叶绿体 Rubisco 酶的分离：按照植物组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5～10的比例（建议称取约 0.1g 样本，加入 1mL 提取液一），冰浴匀浆后于 4℃，200g 离心 5min， 弃沉淀，取上清在 4℃，8000g 离心 10min，取上清用于测定胞浆 Rubisco 酶活性，取沉淀加 1mL 提取液二，震荡溶解后超声破碎（冰浴，200W，破碎 3s，间歇 7s，总时间 1min），然后 4℃，8000g 离心 10min，取上清测定叶绿体中 Rubisco 酶活性。
建议测定总 Rubisco 酶活性，按照步骤①提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的
Rubisco，则按照步骤②提取粗酶液。
（注意：粗酶液制备过程中超声破碎操作使用细胞破碎仪进行。）
相关图片：
测定步骤：
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。2、 样本测定
- 工作液的配制：临用前将试剂二和试剂三 1：1 混合，用多少配多少；
- 在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10uL 样本、10uL 试剂四和 180uL 工作液，混匀， 立即记录 340nm 处 20s 时吸光值 A1 和 5min20s 时的吸光值 A2，计算ΔA=A1-A2。
Rubisco 活性计算：
- 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：
单位的定义：25℃中 1 mg 蛋白 1 min 氧化 1 nmol NADH。
Rubisco（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T =643×ΔA÷Cpr 此法需要测定粗酶液中蛋白质浓度，建议选购本公司生产的 BCA 蛋白质浓度测定试剂盒。2、按样本鲜重计算
单位的定义：25℃中 1 g 组织 1 min 氧化 1nmol NADH。
Rubisco（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=643×ΔA÷W
上述计算公式中各符合含义：
V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5min；W：样本质量，g。
- 使用 96 孔板测定的计算公式如下：
单位的定义：25℃中 1 mg 蛋白 1 min 氧化 1 nmol NADH。
Rubisco（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T =1286×ΔA÷Cpr 此法需要测定粗酶液中蛋白质浓度，建议选购本公司生产的 BCA 蛋白质浓度测定试剂盒。2、按样本鲜重计算
单位的定义：25℃中 1 g 组织 1 min 氧化 1nmol NADH。
Rubisco（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=1286×ΔA÷W
上述计算公式中各符合含义：
V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.01mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T： 反应时间，5 min；W：样本质量，g。
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文献和实验核酮糖二磷酸加氧酶 ribulose-diphosphateoxygenase
为催化核酮糖二磷酸被分子氧氧化而产生甘油酸 -3-磷酸和乙醇酸磷酸的酶。实际就是核酮糖二磷酸羧化酶（ EC4． 1． 1． 39），此酶除具羧化酶活性之外，在有氧时也具有加氧酶的活性。是构成光呼吸或氧对光合作用抑制（瓦布格效应）的原因。
植物绿色组织在光下吸收氧气和释放二氧化碳的过程。其底物是乙醇酸，它的主要来源是核酮糖-1，5-二磷酸（RuBP）与氧气在RuBP羧化酶加氧酶的催化下，形成1分子磷酸甘油酸及1分子磷酸乙醇酸，后者在磷酸酯酶催化下形成乙醇酸。由于RuBP是在光下不断循环形成（见光合作用），所以光呼吸依赖于光。由于RuBP羧化酶加氧酶既可催化RuBP发生羧化反应，又可催化RuBP与氧气发生加氧反应。所以，二氧化碳与氧气浓度之比将影响其速率。C4 植物的速率很低，几乎测不出，这主要是由于C4 植物
尔化学奖。（一）C3途径的反应过程C3途径是光合碳代谢中最基本的循环，是所有放氧光合生物所共有的同化CO2的途径。1.过程 由RuBP开始至RuBP再生结束，共有14步反应，均在叶绿体的基质中进行。全过程分为羧化、还原、再生3个阶段。(1)羧化阶段(carboxylation phase) 指进入叶绿体的CO2与受体RuBP结合，并水解产生PGA的反应过程。以固定3分子CO2为例：3RuBP+3CO2+3H2O PGA + 6H+核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)具有双重功能，既能使RuBP
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