α酮戊二酸脱氢酶（α-KGDH）测试盒

α-酮戊二酸脱氢酶（α-KGDH）活性测定试剂盒

微量法 100 管/96 样

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

α-KGDH（EC 1.2.4.2）广泛存在于动物、植物微生物和培养细胞的线粒体中，是三羧酸循环调控关键酶之一，催化 α-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰辅酶 A。

测定原理

α-KGDH 催化 α-酮戊二酸、NAD+ 和辅酶 A 生成琥珀酰辅酶 A、二氧化碳和 NADH，NADH
在 340 nm 有特征吸收峰，以 NADH 的生成速率表示α-KGDH 活性。

需自备的仪器和用品

紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

试剂一：100mL×1 瓶，-20℃保存； 试剂二：20mL×1 瓶，-20℃保存； 试剂三：1.5mL×1 支，-20℃保存； 试剂四：液体 20mL×1 瓶，4℃保存； 试剂五：粉剂×1 瓶，-20℃保存；
试剂六：粉剂×1 支，-20℃保存；

样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
1、 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2、 将匀浆 600g，4℃离心 5min。
3、 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。
4、 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的 α-KGDH（此步可选做）。
5、 在步骤④的沉淀中加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率 20％或
200W，超声 3 秒，间隔 10 秒，重复 30 次），用于线粒体 α-KGDH 活性测定。

测定步骤

1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
2、 样本测定

1. 在试剂五中加入 18mL 试剂四充分溶解，置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种） 水浴 10min；现配现用；
2. 在试剂六中加入 1mL 蒸馏水，充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
3. 在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 样本、10μL 试剂六和 180μL 试剂五，混匀，立即记录 340nm 处 20s 时的吸光值 A1 和 2min20s 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A2-A1。

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