NAD激酶（NADK）测试盒

NAD 激酶（NAD kinase, NADK）试剂盒说明书

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

NADK（EC 2.7.1.23）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是目前所发现的生物体内惟一能够催化NAD+磷酸化生成 NADP+的酶，可催化 NAD(H)以 ATP 或无机duo聚磷酸[poly(P)]作为磷酰基供体进行磷酸化反应，生成 NADP(H)。因此，NAD 激酶在合成NADP(H)以及调节NAD(H)与 NADP(H)的平衡上具有重要作用。
 

测定原理：

NADK 催化NAD+磷酸化，生成 NADP+；NADP+可被 6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原为 NADPH； 在 340 nm 下测定 NADPH 增加速率。可反映出 NADK 活性的大小。
 

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板和蒸馏水。
 

试剂的组成和配制：

提取液：液体 100 mL×1 瓶，4℃保存； 试剂一：液体 10 mL×1 瓶，4℃保存； 试剂二：液体 25 mL×1 瓶，4℃保存； 试剂三：粉剂×1 瓶，-20 ℃保存；
试剂四：粉剂×1 瓶，-20℃保存；
 

样本测定的准备：

1、细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量
（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）样品：直接检测。

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测定步骤

1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
2、将试剂一和试剂二 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 15min 以上。
3、工作液Ⅰ的配制：在试剂三中加入 5mL 试剂一，充分混匀待用；用不完的试剂分装后-20℃ 保存，禁止反复冻融；
工作液Ⅱ的配制：在试剂四中加入 18mL 试剂二，充分混匀待用；用不完的试剂分装后
-20℃保存，禁止反复冻融；
4、加样表

试剂名称(μL)	测定孔	对照管
样本	20	20
工作液Ⅰ	80
试剂一		80

充分混匀，37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 15min，立即煮沸2min（盖紧，防止水分散失）冰浴冷却，10000g，25℃离心 10min，取上清

上清液	40	40
工作液Ⅱ	160	160

加完试剂混匀，室温静置 15min，340nm 下测定吸光值，ΔA=A 测定-A 对照。
NADK 活性计算：

1. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、血清（浆）NADK 活力的计算:
单位的定义：每 mL 血清（浆）每分钟生成 1 nmol 的 NADP 定义为一个酶活力单位。
NADK（nmol/min/mL）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷V 样÷T=53.59×ΔA 2、组织、细菌或细胞中 NADK 活力的计算:

1. 按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol NADP 定义为一个酶活力单位。
NADK（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=53.59×ΔA÷Cpr

2. 按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g 组织每分钟生成 1 nmol NADP 定义为一个酶活力单位。
NADK（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=53.59×ΔA÷W

3. 按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol NADP 定义为一个酶活力单位。NADK（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=0.107×ΔA V 反总：反应体系总体积，1×10-4 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d： 比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.02 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T： 反应时间，15 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

2. 用 96 孔板测定的计算公式如下

1、血清（浆）NADK 活力的计算:
单位的定义：每 mL 血清（浆）每分钟生成 1 nmol 的 NADP 定义为一个酶活力单位。
NADK（nmol/min/mL）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷V 样÷T=107.18×ΔA 2、组织、细菌或细胞中 NADK 活力的计算:

1. 按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol NADP 定义为一个酶活力单位。
NADK（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=107.18×ΔA÷Cpr