Bsu DNA Polymerase, Large Frag

碧云天生产的Bsu DNA Polymerase, Large Fragment，即枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis, Bsu) DNA聚合酶大片段，具有5'→3' DNA聚合酶活性，不具有3'→5'和5'→3'的核酸外切酶活性。Bsu DNA聚合酶大片段具有链置换(Strand displacement)活性，常用于重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification, RPA)，其等温扩增(Isothermal amplification)的温度通常为37ºC。

Bsu DNA Polymerase, Large Fragment是将枯草芽孢杆菌DNA聚合酶I的5'→3'核酸外切酶结构域(1-296 aa)删除后表达剩余蛋白序列而获得。该酶保留了枯草芽孢杆菌DNA聚合酶I的5'→3'聚合酶活性，但缺失了5'→3'核酸外切酶和3'→5'核酸外切酶活性。

重组酶聚合酶扩增(RPA)主要包括以下几个组分：重组酶(Recombinase) T4 UvsX，重组酶载入因子(Recombinase loading factor) T4 UvsY，Bsu DNA聚合酶大片段以及单链DNA结合蛋白(Single-strand binding protein) T4 gp32。在ATP存在的情况下，UvsX与引物相结合，扫描DNA模板，寻找到与引物配对的核酸序列，一旦引物被定位到了DNA模板的同源序列，ATP水解产生ADP，ADP与UvsX的结合导致UvsX被gp32取代而从DNA模板上解离下来，gp32作为单链结合蛋白可以稳定被置换的DNA链的结构，Bsu DNA聚合酶大片段因引物与DNA模板的配对而进行引物的延伸和模板的扩增。重组酶载入因子T4 UvsY和拥挤试剂(Crowding reagent) Carbowax20M的加入有利于UvsX与引物的结合，即有利于重组酶UvsX的载入。

碧云天生产的Bsu DNA Polymerase, Large Fragment催化延伸DNA模板的效果请参考图1。

图1.碧云天生产的Bsu DNA Polymerase, Large Fragment (D7055)催化延伸DNA模板的效果图。使用本产品或竞争(Competitor) N公司的Bsu DNA Polymerase, Large Fragment，在20µl反应体系中加入图中指定量的本产品或N公司的Bsu DNA Polymerase, Large Fragment，37ºC孵育15min进行反应。反应完毕后冰浴3-5min，75ºC孵育20min以终止反应。取出5μl反应液，加入1μl 6X DNA Loading Buffer，然后进行15%非变性聚丙烯·酰胺凝胶电泳(180V电泳60min)；之后用Gel-Red (D0140)室温染色15min，然后进行拍照记录。如图所示，本产品与N公司的产品相比，具有类似的催化效果。反应体系(20μl): 10mM Tris-HCl (pH7.9 at 25ºC), 50mM NaCl, 10mM MgCl2, 1mM DTT, 125µM dNTP Mix, 0.5µM Template/Primer (Template: 5'-ATACATAGATACATAGACTGGCCGTCGTTTTAC-3 / Primer: 5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'); Primer和Template按照D0251产品说明书中推荐的程序进行退火反应，之后以Primer/Template退火产物为底物，进行DNA模板的延伸。实际操作时不同实验条件获得的实验结果会略有差异，图中所示结果仅供参考。

碧云天生产的Bsu DNA Polymerase, Large Fragment在RPA反应中的作用效果请参考图2。

图2.碧云天Bsu DNA Polymerase, Large Fragment (D7055)在RPA反应中的作用效果图。以pUC18为模板，使用正向引物Primer-F (5'-AGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCC-3')和反向引物Primer-R (5'-TGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACA-3')进行RPA反应。配制50µl反应体系: 包含缓冲液, dNTPs, pUC18, Primer-F, Primer-R, UvsX (D7059), UvsY (D7061), gp32 (D7057), 0.4U/µl Bsu DNA Polymerase, Large Fragment (D7055)。设置无pUC18的阴性对照，以及无UvsX、无UvsY、无gp32和无Bsu DNA polymerase, Large Fragment的对照。配制好反应体系后，最后统一将Mg(Ac)2加到管壁上，离心以启动反应，39ºC孵育30分钟，随后60ºC加热10分钟。反应结束后离心，从每管取出4μl样品，分别加入0.8µl DNA上样缓冲液(6X) (D0071)，然后电泳并进行核酸染色和荧光成像分析，产物为长度为293bp的片段。结果表明UvsX、gp32、Bsu DNA polymerase, Large Fragment对于RPA反应都是必需的。当体系中不含UvsY时，可以观察到微弱的条带，说明UvsY可以提高RPA反应的效率。实际效果会因样品种类、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

用途：RPA法等温扩增；RPA链置换的DNA合成；随机引物法标记；cDNA第二条链合成；单个dA的加尾。

来源：大肠杆菌表达枯草芽孢杆菌DNA聚合酶I基因(297-880 aa)获得的重组蛋白。

活性定义：One unit is defined as the amount of enzyme that will incorporate10 nmol dNTPs into acid insoluble material in 30 minutes at 37ºC.

纯度：不含DNA内切酶和外切酶，不含核糖核酸酶。

酶储存液：25mM Tris-HCl (pH7.4), 50mM NaCl, 1mM DTT, 0.1mM EDTA, 50% (v/v) Glycerol.

10X Reaction Buffer: 100mM Tris-HCl (pH7.9 at 25ºC), 500mM NaCl, 100mM MgCl2, 10mM DTT.

失活或抑制：75ºC孵育20min。

包装清单：

保存条件：

-20ºC保存。

注意事项：

由于缺乏3'→5'核酸外切酶活性，Bsu DNA Polymerase, Large Fragment不能切除3'未配对的突出末端，因而不适用于产生平末端。

Bsu DNA Polymerase, Large Fragment 25ºC时仍保留50%的DNA聚合酶活性，是相同温度下Klenow片段(3'→5' exo-)活力的两倍。

配制RPA反应体系时，会出现白色沉淀，属于正常现象，不影响实验结果。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。