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- 文献和实验
- 技术资料
- 库存：
20
- 细胞类型：
见详情说明
- 品系：
见详情说明
- 组织来源：
见详情说明
- 相关疾病：
见详情说明
- 物种来源：
大鼠
- 免疫类型：
见详情说明
- 细胞形态：
贴壁/悬浮
- 器官来源：
见详情说明
- 运输方式：
常温/干冰运输
- 年限：
见详情说明
- 生长状态：
优良
- 规格：
5×105cells/T25培养瓶
一、从液氮容器中取出原代细胞冻存管后，立即将细胞冻存管直接浸入37℃水浴中，在1－2分钟内摇动细胞冻存管至冻存的细胞融化。
二、用75％酒精消毒细胞冻存管后，小心打开盖子，用吸管吸出细胞悬浮液，接种到细胞培养瓶中，5%CO2、95%空气、37oC培养箱静置培养。
三、12小时后，更换一次原代细胞培养液（全部液体），继续在5%CO2、95%空气、37oC培养箱静置培养 。
注意事项
一、将冻存管从液氮容器中取出时，要做好防护工作，以免冻伤。
二、取冻存管后立即放入37oC水浴中，缩短解冻时间。
三、复苏最好用新配制的原代细胞培养体系。
原代细胞传代基本技术：
一、选用原代细胞生长状态好（90－95％），生长数量大于5×105进行传代。
二、吸除原代细胞培养液。用含双抗的1×PBS（pH7.4）清洗细胞培养瓶2次。
三、3ml细胞消化液加入细胞培养瓶，轻轻摇动，使细胞消化液覆细胞培养瓶底。
四、细胞培养瓶置于5%CO2、95%空气、37oC培养箱静置培养2分钟后，在显微镜下观察原代细胞的消化状态。（平滑肌细胞建议只消化30s）
请记住：如贴壁细胞逐渐趋于圆形、部分悬浮后，用手指轻轻拍打细胞培养侧部至大部分贴壁细胞悬浮，加入3ml血清终止液，终止细胞消化。每种原代细胞的消化时间是有差异的。
五、吹打培养瓶中悬浮细胞若干次，再吸出细胞悬浮液，转入15ml离心管中，1000rpm离心5分钟。
六、弃离心管中液体，加入原代细胞培养液重悬细胞。细胞计数，确定细胞数量。
七、细胞分瓶后，加入适量原代细胞培养液至细胞培养瓶中，置于5%CO2、95%空气、37oC培养箱静置培养24小时。
原代细胞冻存基本技术：
一、选用原代细胞生长状态好（90－95％），生长数量大于5×105进行冻存。
二、原代细胞冻存24小时，须换液新鲜原代细胞培养液一次。
三、贴壁的原代细胞需常规用0.25％胰酶消化，将消化后的细胞悬液收集至细胞离心管中。
四、细胞离心管在1000rpm下离心5分钟，小心弃清液。
五、将细胞冻存液加入细胞离心管中，悬浮细胞。细胞计数调整至5×105/ml。
六、将悬浮细胞放置细胞冻存管中。密封细胞冻存管。 标明细胞种类和冻存日期。
请记住：封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。
请按下列顺序降温保存原代细胞：室温→4℃（60 分钟）→ 冰箱冷冻室（60 分钟）→ 超低温冰箱（－80℃过夜）→ 液氮。
原代细胞冻存液常用配方：50%完全原代细胞培养液（不含有血清、添加剂、双抗）+ 40%胎牛血清 + 10%DMSO
原代细胞免疫荧光鉴定：
一、原代培养的细胞用 4%的多巨甲醛，室温固15 min，0.1% Triton-X-100 透膜 10 min，PBS 清洗 3 遍，每5 min，
二、山羊血清室温封闭45 min，一抗 Insulin，兔多抗，使用浓度 1 ∶ 50；Glucagon 抗体，鼠单抗，使用浓度 1 ∶ 200；
Pancreatic Polypeptide（pp）抗体，兔多抗，使用浓度1∶200，4 ℃孵育过夜，PBS 清洗 3 遍，每次 5 min，
三、加入相应的二抗 Alexa Flour 594 （山羊抗兔）或FITC（山羊抗小鼠），室温避光孵育 45 min，PBS
清洗 3 遍，每次 5 min，
四、DAPI 复染核，PBS 清洗 3遍，每次 5 min，普通荧光显微镜下观察并照相.
五、实验结果：
Insulin（200X）：图中红色荧光为Insulin阳性，阳性率＞90%，即：细胞纯度＞90%
原代细胞培养客户须知：
一、请客户收到本公司原代细胞产品后，立即对物品包装、细胞培养瓶等拍照，如有疑问或问题，须在24小时内通知本公司，提供照片和书面说明。
客户收到非冻存原代细胞后，请将原装的原代细胞瓶放入细胞培养箱内培养，4-12小时后再使用。75ml培养液含添加剂，血清及双抗，可吸出70ml左右直接使用，无需过滤。注意观察细胞情况，待贴壁率达到90%以上再按传代说明操作。
二、请客户使用T25细胞瓶传代，一瓶传二瓶。
三、谨记：培养原代细胞前三天，需对原代细胞生长状态进行拍照并注明和标记时间。若原代细胞培养生长存在质量问题，需向本公司提供原代细胞培养生长的照片和书面说明。
四、请客户使用原代细胞第3代以内。原代细胞培养传代过多，可能造成原代细胞的质量问题。
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文献和实验实验方法： 1. 在无菌条件下取出新生大鼠（10g）的腮腺或颌下腺组织，仔细分离腺体周围的结缔组织，用无Ca2+ 、Mg2+ 的D-Hanks液将腺组织冲洗干净； 2. 将腺体组织剪成1—2mm3大小的植块，洗净植块上的血液和粘液； 3. 按一定密度（即植块与植块之间相距2mm左右），将植块种植到包被有鼠尾胶原的盖玻片上； 4. 加入DMEM培养液。每周换液1次； 5. 细胞长满后，在细胞传代的过程中去除植块。
本人把大鼠原代肾小管上皮细胞的取材、培养方法进行了总 结，请分享！ 取材：1.肾小管节段的分离(机械网筛滤过法)： ①取 Wistar 大鼠断颈法处死，立即置入碘伏液中浸泡 5 分钟。 ②将大鼠转移入超净工作台，取腰部切口迅速取出肾脏，置于盛有生理盐水的培养皿中清洗并除去包膜和肾蒂组织。 ③取皮质置于80目筛网上，剪碎成1-2mm3大小组织块，网下放盛有少量生理盐水的培养皿。 ④用玻璃注射器内芯于80目网上充分研磨组织。 ⑤收集 80 目网下液体转移至 100
实验材料： 1. 正常大鼠的肺组织； 2. 不含Ca2+ 和Mg2+ 的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L链霉素，pH7.2； 3. 肺泡灌洗液Ⅰ：140 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、2.5 mmol/L磷酸缓冲液、10 mmol/L HEPES、6 mmol/L葡萄糖和0.2 mmol/L EDTA。用无菌双蒸水配制，pH7.4，肺泡灌洗液使用时须预温到37℃； 4. 肺泡灌洗液Ⅱ：在灌洗液Ⅰ中加入2.0 mmol/L
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