间充质干细胞成软骨诱导分化试剂盒

间充质干细胞成软骨诱导分化试剂盒

产品描述

本产品为团队精心优化的间充质干细胞成软骨诱导分化试剂盒，可增强间充质干细胞 向成软骨细胞分化的能力。

本产品仅用于科研用途，不可用于诊断、治疗、临床、家庭及其他用途。

产品组成成分及保存

 

试剂名称 体积（100mL规格/200mL规格） 保存条件

诱导分化添加剂 Ⅰ 5mL / 10mL -20℃ , 1 Year

诱导分化添加剂Ⅱ 1mL / 2mL -20℃ , 1 Year

优质胎牛血清 10mL / 20mL -20℃ , 1 Year

细胞基础培养基 84mL / 168mL 4℃ , 1 Year

苯胺蓝染色液 5mL / 10mL RT（室温），1 Year

  注意：1.为保证产品的有效性，请避免反复冻融。

2.诱导分化添加剂Ⅱ须现用现配，加入培养基后，须在12小时内用完，否则可能影响实验效果。 3.配制好的诱导分化预混液（不含诱导分化添加剂Ⅱ) 保存于2-8℃ , 有效期为2周。

产品使用说明（2D/3D培养）

1.成软骨诱导分化培养基的配制

①室温条件下融化添加剂及血清。（注意：若添加剂或血清中有沉淀物，属正常现象，无须 过滤，避免成分丢失。）

②配制诱导分化预混液：以下简称预混液。根据实验用量，于无菌操作台中配制。建 议每次配制50mL ，先加细胞基础培养基和胎牛血清，再加诱导分化添加剂。（配制 比例见表一）

 

试剂成分 配制比例 50mL配制体系

诱导分化添加剂 Ⅰ 5% 2.5mL

优质胎牛血清 10% 5mL

细胞基础培养基 85% 42.5mL

表一

 

 

③配制诱导分化完全培养基：根据实验用量，按照1%的比例向预混液中添加诱导分化 添加剂Ⅱ , 如每1mL预混液添加10uL诱导分化添加剂Ⅱ 。（注意：诱导分化添加剂Ⅱ须 现用现加，配制完成的诱导分化完全培养基12h内使用完，否则将失效。）

2.2D成软骨诱导分化实验步骤

①建议取第3~5代、纯度达90%以上、状态良好的间充质干细胞，将其消化下来，离心 收集，使用含10%FBS的培养基调整细胞密度，均匀铺于培养瓶/板中。将接种好的 细胞置于37℃ , 5%CO2 ，饱和湿度的培养箱中培养。（细胞接种详情参考表二）

 

培养器皿 底面积 细胞量 培养液体积

24孔培养板 2cm/孔 2×105cell/孔 1mL/孔

12孔培养板 4.5cm/孔 4.5×105cell/孔 2mL/孔

6孔培养板 9.6cm/孔 9.6×105cell/孔 2mL/孔

T25培养瓶 25cm 25×105cell 5mL

6cm培养皿 21cm 21×105cell 5mL

10cm培养皿 55cm 55×105cell 10mL

表二

②待细胞汇合度达80%~ 100%时，即可进行诱导分化。

③小心吸弃细胞培养上清，沿孔壁缓慢加入提前配制好的诱导分化完全培养基，置于 37℃恒温细胞培养箱中培养。（注意：完全培养基加入细胞前需提前置于37℃预热。）

④每2day~3day换用新鲜的诱导分化完全培养基。换液时，若细胞培养上清颜色变为澄 清的黄色，是由于细胞量较大，培养基消耗较快导致的，请及时调整为每日换液。

（注意：完全培养基加入前需提前置于37℃预热。）

⑤细胞诱导3周后，即可进行苯胺蓝染色鉴定。

3.2D成软骨细胞苯胺蓝染色分析

①细胞诱导分化结束后，小心吸弃细胞培养上清，1×PBS润洗1~2次，室温固定30 min。

（细胞固定液为4%中性醛溶液等，体积参考表二）

②吸弃细胞固定液，1×PBS润洗2次。沿孔壁缓慢加入苯胺蓝染色液，染液体积请  参考表二，室温染色30min 。（注意：染色液底部可能会有沉淀，吸取时尽量不要触及底部。 若染色后有沉淀，1×PBS洗去即可。）

③吸出染色液，1×PBS润洗，去掉浮色。显微镜下观察细胞染色效果，背景呈淡蓝色， 成软骨细胞呈紫红色。（注意：染色液可重复使用，建议收集。）

 

2D成软骨细胞苯胺蓝染色（图片仅供参考） 左图：100倍；右图：200倍

 

4.3D成软骨诱导分化实验步骤

①建议取第3~5代、纯度达90%以上、状态良好的间充质干细胞，将其消化下来，计数。 调整细胞浓度，按照每管3~4×105cell将细胞转移至15mL离心管中，20℃ , 250×g    离心4min。

②弃上清，每管加入0.5mL预混液，重悬细胞沉淀。20℃ , 150×g离心5min。

③弃上清，每管加入0.5mL成软骨诱导分化完全培养基重悬细胞沉淀，20℃ , 150×g 离心5min。

④将离心管树立放置于37℃ , 5%CO2 ，饱和湿度的培养箱中培养，拧松离心管盖以便 于气体交换。（注意：此步骤无需重悬细胞，且24h内不可晃动离心管。）

⑤约24h~48h后，细胞出现聚团现象，轻弹离心管底部使软骨球脱离管底悬浮于培养液 中。

⑥每2~3day换用新鲜的诱导分化完全培养基，持续诱导三周后，即可将培养液更换为 固定液（4%中性醛），将软骨球固定，后续进行切片染色鉴定实验。

 

 

3D成软骨球石蜡切片-阿利辛蓝染色（图片仅供参考） 左图：40倍；右图：100倍

 

质量控制

  无菌检测（细菌、真菌和支原体检测）

   pH测试

  渗透压检测   内毒素

相关产品

l 间充质干细胞

l 原代间充质干细胞无血清培养体系

l PBS缓冲液