人单纯疱疹病毒 1IgG 抗体（HSV1-IgG）试剂盒（E

人单纯疱疹病毒1IgG抗体（HSV1-IgG）试剂盒（ELISA）

使用说明书

 

规格：48T/96T

检测范围：25→800 ng/mL

特异性：结构类似物无交叉

灵敏度：<1.0 ng/mL

重复性：板内变异系数均<10%，板间变异系数均<15%。

保存、有效期：2-8℃保存6个月

用途：定量检测血清、血浆、细胞培养上清液等样本中人单纯疱疹病毒1IgG抗体（HSV1-IgG）的浓度。

实验原理

本试剂盒采用间接法酶联免疫吸附试验（ELISA）。在预包被人单纯疱疹病毒1IgG抗体（HSV1-IgG）捕获抗原（固相抗原）的微孔酶标板中，加入人单纯疱疹病毒1IgG抗体（HSV1-IgG）校准品和待测样本，再加入另一株HRP标记的抗人单纯疱疹病毒1IgG抗体（HSV1-IgG）抗体（酶标抗体），经过温育与充分洗涤，去除未结合的组分，在微孔板固相表面形成固相抗原-抗体-酶标抗体的夹心复合物。加底物A和B，底物在HRP催化下，产生蓝色产物，在终止液（2M 硫酸）作用下，最终转化为黄色，在酶标仪450nm波长上测定吸光度（OD值），吸光度（OD值）与待测样品中人单纯疱疹病毒1IgG抗体（HSV1-IgG）的浓度正相关。拟合校准品曲线，可以计算出样本中人单纯疱疹病毒1IgG抗体（HSV1-IgG）的浓度。

 

试剂盒限制性

1、供科研使用，不得用于临床诊断。

2、在试剂盒标示的有效期内使用，过期产品不得使用。

3、跟其他厂家的试剂盒或者组分不能混用。

4、使用试剂盒配套的样品稀释液。

5、如果样本值高于最高标准品浓度值，请将样本适当稀释后，再重新测定。

6、待测样本中存在的人抗鼠等异嗜抗体会干扰检测结果，检测前，请排除该因素。

7、通过其他方法得到的检测结果，与本试剂盒测定结果不具有直接的可比性。

技术提示

1、混合蛋白溶液时，避免起泡。

2、加校准品与样本时，每个校准品浓度和样本都要更换移液枪头，公共组分应该悬臂加样，避免交叉污染。

3、合适的温育时间，和充分的洗涤步骤，是保证实验结果准确性的必要条件。

4、使用自动洗板机时，加入一个30秒浸泡的步骤，可以提高检测精度。

5、底物溶液为无色液体，保存过程中变为蓝色，代表底物溶液已经失效，不得使用。

6、终止液加样顺序与底物溶液加样顺序一致，加入终止液后，蓝色底物产物，会瞬间变为黄色。

7、实验中，用剩的板条，应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。

8、所有液体组分，使用前充分摇匀，严格按照说明书标明的时间、加样量及加样顺序进行温育操作。

 

未提供仪器用品

1、酶标仪（450nm）

2、精密移液器及一次性吸头

3、蒸馏水

4、洗瓶或者自动洗板机

5、37℃水浴锅或恒温箱

6、500ml量筒

试剂盒组分与保存

未开封的试剂盒保存在2-8度，不得使用过期试剂盒。

组分	数量	主要成分	开封后储存
校准品	0.3ml/管	--	2-8℃14天
包被微孔板	96T/48T	预包被固相抗原	2-8℃14天
HRP标记抗体	10mL	HRP标记的检测抗体	2-8℃180天
样本稀释液	6mL	--	2-8℃180天
底物液A	6mL	0.01%过氧化氢	2-8℃180天
底物液B	6mL	0.1%TMB	2-8℃180天
终止液	6mL	2mol/L稀硫酸	2-8℃180天
20×浓缩洗涤液	25mL	0.05%Tween20	2-8℃180天
说明书	1份	--	--
自封袋	1个	--	--
不干胶	2片	--	--

校准品浓度依次为：800、 400、 200、 100、 50、 25 ng/mL。

注意：

1：如果试剂盒的组份需要再次使用，请确保上一次使用之后没有被污染。

2：酶标板单次未使用完，要谨记密封放到2-8℃保存。

生物安全

1、检测必须符合实验室管理规范的规定，严格防止交叉污染，所有样品、洗弃液和各种废弃物都应按照传染物进行处置。

2、试剂盒的液体组分中，含有proclin-300防腐剂，可能引起皮肤过敏反应，避免吸入烟雾。

3、避免与皮肤接触。

4、底物液对皮肤、眼睛和上呼吸道有刺激作用，避免吸入烟雾。

5、戴上防护手套，实验完成后彻底洗手。

样品的采集和储存

以下只是列出样品采集和保存的一般指南。所有样本采集保存过程中，不得使用叠NA做为防腐剂。

1、细胞培养上清：4000rpm条件下离心20min，去除细胞颗粒和聚合物，上清液保存在- 20℃以下，避免反复冻融。

2、血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，4000rpm条件下离心20min，小心地分离出血清，保存在-20℃以下，避免反复冻融。

3、血浆：肝素，EDTA，或柠檬酸钠作为抗凝剂。在4000rpm条件下，离心20分钟取上清，血浆保存在-20℃以下，避免反复冻融。

样本收集后，无法一次检测完毕，请按一次用量分装冻存，避免反复冻融，使用时在室温下解冻，确保样品均匀充分解冻。

4、组织匀浆：用预冷的PBS (0.01 M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液，称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按1: 9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9 mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中，在冰上充分研磨。

为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎或反复冻融。最后将匀浆液5000×g离心 5-10分钟，取上清检测。

5、细胞提取液：贴壁细胞用冷的PBS轻轻清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g离心5分钟后收集细胞；悬浮细 胞可直接离心收集。收集的细胞用冷的PBS洗涤3次。每 1×106 个细胞中加入150-200μLPBS重悬并通过反复冻融使细胞破碎(若含量很低可减少PBS的体积)。将提取液于1500×g离心10分钟，取上清检测。  

6、其他生物体液：1000×g 离心20分钟，除去杂质及细胞碎片。取上清检测。

试剂准备

1、使用前，样本和试剂盒所有的组分都要至少复温120min，确保充分复温到室温。

2、浓缩洗涤液：从冰箱取出的浓缩洗涤液，会有结晶产生，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解。浓缩洗涤液与蒸馏水，按1:20稀释，即1份的浓缩洗涤液，添加19份的蒸馏水。

3、底物：底物液A和B，在使用前，按1:1体积充分混合，混合后15分钟内使用。

 

操作程序

所有试剂和组分都先恢复到室温，标准品、质控品和样品，建议做复孔。

1、按前面说明书描述的方法，配制好试剂盒各种组分的工作液。

2、从铝箔袋中取出所需板条，剩余的板条用自封袋密封放回冰箱。

3、设置标准品孔、0值孔、空白孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL，0值孔加样本稀释液50μL，空白孔不加，样本孔加待测样本50μL。

4、除空白孔外，标准品孔、0值孔和样本孔，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL。

5、用封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱避光孵育60min。

6、揭开封板膜，弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置20S，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复5次。若使用自动洗板机，请按洗板机操作程序进行洗板，添加浸泡30s的程序，可以提高检测的精度。洗板结束，加底物前，要在干净不掉屑的纸上，充分拍干反应板。

7、将底物A和B按1:1体积充分混合，所有孔中加入底物混合液100μL。用封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱避光孵育15min。

8、所有孔加入终止液50μL，在酶标仪450nm波长上读取各孔吸光度（OD值）。

结果计算

1、以标准品浓度做为横坐标（6个标准品孔，加1个0值孔，共7个浓度点），对应的吸光度（OD值）作为纵坐标，利用计算机软件，采用四参数Logistic曲线拟合（4-pl），创建标准曲线方程，通过样本的吸光度（OD值），利用方程计算样品的浓度值。

2、如果样品被稀释，通过上述方法测的浓度值，要乘以稀释倍数，才是样品的最终浓度。

典型数据

以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线。

浓 度 ： ng/mL	25	50	100	200	400	800
OD值	0.1337	0.2367	0.324	0.601	1.0579	2.314

试剂盒性能指标

1、物理性能

试剂盒的各液体组分应澄清透明、无沉淀或者絮状物。微孔板铝箔袋应真空包装，无破损漏气。

2、剂量反应曲线线性

校准品剂量反应曲线相关系数r值，大于等于0.9900。

3、精密度

批内精密度：三组已知的高、中、低浓度样品，进行二十次在同一个板块内精度评估。

批间精密度：三组已知的高、中、低浓度样品，进行二十次在不同板块内精度评估。

	批内变异系数			批间变异系数
样本	1	2	3	1	2	3
数量	20	20	20	20	20	20
平均值(ng/mL)	54.5	99	452	41	94	420
标准差	4.05	6.41	24.77	2.51	7.88	47.75
变异系数 (%)	7.43	6.47	5.48	6.12	8.38	11.37

4、灵敏度

最低检出剂量小于1.0 ng/mL (6 次独立实验的平均值)。

10个零标准品浓度 OD 的平均值加上两倍 SD，计算最低可检测浓度。

5、回收率

分别往不同样本中添加已知的高、中、低浓度目的蛋白样品，进行五次在同一个板块内回收率评估，回收率在85%-115%之间。