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- 2025年07月11日
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- 库存：
100
- 供应商：
上海研生
- 规格：
48T 0.2PCR管
PCR实验方法步骤：
方法
1：在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer
5 μl dNTP mix （2mM）
4 μl 引物1（10pM）
2 μl 引物2（10pM）
2 μl Taq酶 （2U/μl）
1 μl DNA模板（50ng-1μg/μl）
1 μl 加ddH2O至 50 μl
视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
2：调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，在72℃ 保温7min。
3：结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。 4：PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μl进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。
产品特点:
灵敏度高：可检测个位拷贝数的基因
特异性高：有效避免非特异性扩增的出现
稳定性高：复孔间差异小，实验结果重复性强
扩增性能优：扩增效率高，荧光信号强
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实时荧光定量PCR：
实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的： 1）Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。 2）Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。 外标准曲线的定量方法相比内标法是一种准确的、值得信赖的科学方法。利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量最准确，重现性定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。
定量PCR方法：
a、竞争法
选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。 b、内参照法
在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。
c、PCR－ELISA法
利用di高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗di高辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色。常规的PCR－ELISA法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的。
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文献和实验的DNA ，在实际操作中就需要较大量的植物材料来提取DNA ，而转基因植物的愈伤组织在无菌条件下经过筛选、重新分化后一般都比较细弱，不宜大量取样。如果外源基因在插入时发生基因重组，造成限制性酶切位点丢失，Southern 法也无法检测到。这些因素都制约了Southern法在T0代植物中检测外源基因拷贝数的应用。 二、荧光定量PCR方法 利用新型、灵敏、高通量的实时荧光定量PCR方法可以用于测定原始品系中转基因的绝对拷贝数。实时荧光定量PCR技术是一种较新的DNA 定量方法。其定量的基本
测量和鉴别非常微量的特异性核酸，从而可通过监测 CT 值而实现对原始目标基因的含量定量。实时荧光定量 PCR 法最大的优点是克服了终点 PCR 法进入平台期或叫饱和期后定量的较大误差，实现 DNA/RNA 的精确定量。 该技术不仅实现了对 DNA/RNA 模板的定量，而且具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点，该技术在医学临床检验及临床医学研究方面有着重要的意义。 microRNA 实时荧光定量 PCR 的技术特点 虽然 microRNA 实时
可分为荧光探针和荧光染料。荧光探针又包括Beacon技术（分子信标技术，以美国人Tagyi为代表）、 TaqMan探针（以美国ABI公司为代表）和FRET技术（以罗氏公司为代表）等；荧光染料包括饱和荧光染料和非饱和荧光染料，非饱和荧光染料的典型代表就是现在最常用的SYBR GreenⅠ；饱和荧光染料有EvaGreen、LC Green等。 嵌合荧光染料法（SYBR GreenⅠ）SYBR Green I是荧光定量PCR最常用的DNA结合染料，与双链DNA非特异性结合。在游离
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