- ￥2490
- YBio/钰博生物
- YB781500y-14
- 中国
- 2025年07月16日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 库存：
大量
- 英文名：
Bacillus methylotrophicus SYBR qPCR Kit
- 保质期：
一年
- 供应商：
上海钰博生物科技有限公司
- 保存条件：
-20℃保存
- 规格：
50次
Bacillus methylotrophicus SYBR qPCR Kit
甲基营养型芽孢杆菌是一种对人、畜、农作物安全，对环境友好，具有较广的抑菌 谱，对常见的病原菌，如油菜菌核病菌、水稻纹枯病菌、核桃根腐病菌、西瓜枯萎病 菌等菌丝生长均具有较好的抑制效果，进一步制备成的菌剂对油菜菌核病具有显著的 防治效果，生产周期短，在植物病害的生物防治中具有十分广阔的应用前景。本公司 开发甲基营养型芽孢杆菌染料法荧光定量 PCR 试剂盒，它具有下列特点：
1. 即开即用，用户只需要提供病毒 DNA 模板。
2. 引物根据甲基营养型芽孢杆菌专一区设计，特异性高。
3. 荧光定量 PCR 检测，比常规 PCR 更加灵敏。
4. 一管式闭管操作，降低了交叉污染。
5. 本试剂盒足够 50 次 20μL 反应体系的荧光定量 PCR。
6. 本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。
| 编号 | 成分 | 规格 |
| 试剂一 | 2×qPCR MagicMix | 500 μL（棕色管） |
| 试剂二 | 荧光 PCR 专用模板稀释液 | 1 mL（黄盖） |
| 试剂三 | 甲基营养型芽孢杆菌染料法qPCR试剂盒染料法 qPCR 引物混合液 | 100 μL（白盖） |
| 试剂四 | 甲基营养型芽孢杆菌染料法qPCR试剂盒染料法 qPCR 阳性对照(1×10E8 拷贝/μL) | 50 μL（黄盖） |
| 试剂五 | 天净沙核酸释放剂试用装 | 20 次（1mL，绿盖） |
| 使用手册 | 1 份 |
运输及保存 低温运输、-20℃保存，有效期一年。
自备试剂 DNA 模板、10×ROX（根据机型决定，具体见使用方法）。
使用方法 一、稀释 PCR 阳性对照（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）
1. 注意：由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万 不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原， 本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的 DNA 片段作为阳性对 照。
2. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
3. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液（最好用带芯枪头，下同）。
4. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照，充分震荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
5. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)， 充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
6. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照到 5 号管中，充分 震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
7. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
二、样品 DNA 的制备
8. 如果有 N 个样品，必须设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性对照）， 一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 上步制备的 PCR 阳性对照的第 4 号（浓度为 1×10E4 拷贝/μL，10μL 相当于 1 万拷贝）或第 5 号（浓度为 1×10E5 拷贝/μL，10μL 相当于 10 万拷贝）再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求 的体积一样，以此作为 PC。另外用水作为 NC。如果每次制备需要 200μL 样品， 则 PC 和 NC 的体积也必须是 200μL。
9. 用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 DNA 提取试剂盒兼 容。也可以选购本公司的一管式病毒 DNAout 或其升级版柱式病毒 DNAout。本 试剂盒免费赠送 15 次一管式病毒 DNAout，
三、设置 qPCR 反应（20 μL 体系，在样品制备室进行）
10.如果只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个 样品，1 个用于 PCR 阴性对照，6 个用于 PCR 阳性对照。如果做 2-3 次重复，则 反应设置数量相应增加 2 或 3 倍。
11.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕 后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：
| 成分 | 样品管 N+2 个 | PCR 阴性 对照管 | PCR阳性对照管（2-7 管） |
| 2×qPCR MagicMix | 10μL | 10 μL | 各 10 μL |
| 甲基营养型芽孢杆菌染料法qPCR试剂盒染料法 qPCR引物混合液 | 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
| 自备 10×ROX (见注) | 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
| N+2 待测样品 cDNA 模板 | 6 μL | - | - |
| 自备超纯水 | - | 6 | - |
| 第 7 步所得 PCR 阳性对照 稀释液（2-7 号） |
- | - | 各 6μL（2 号样到 2 号管，3 号样到 3 号管…） |
12. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR（具体 PCR 参数可以根据仪器不同而自行优化）。
| 过程 | 温度 | 时间 |
| 预变性 | 95℃ | 5 min |
PCR 反应 （40 个循环） |
95℃ | 15 sec |
| 60℃ |
1 min，（采集 SYBR 通道的荧光信号） |
|
| 按仪器预设程序进行熔解曲线分析 | ||
四、数据处理
13. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵 轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 cDNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。
14. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等 于 34。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 34 则为阴性，如果小于或等于 34 则为 阳性。
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文献和实验实时荧光定量 PCR 技术（Quantitative Real-time PCR，简称 qPCR）是在 PCR 扩增过程中，通过实时监测荧光信号的变化，达到对待检测样本中初始模板定量分析的方法。当前 qPCR 技术被广泛应用于临床疾病诊断，动物疾病监测，食品安全分析等领域。随着 2020 年新冠疫情在全球的蔓延，qPCR 技术更是因其检测通量高，速度快，操作简便等优势成为新冠病毒核酸检测的有效方法被众人所熟知。 那么为了得到可靠、准确的检测结果，我们需要注意哪些方面呢？其实决定一次实验成功
荧光定量 PCR 的常见异常结果除了扩增曲线异常、融解曲线异常两类常见情况外，qPCR 实验中通常还会遇到以下三大类情况： 1. 复孔间重复性差怎么办？ 复孔间重复性差一般会有以下两种情况： （1）CT 值很大，如 CT≥ 30，重复性差属于正常现象。该现象符合泊松分布，即在有效模板量很少的情况下，模板与引物的碰撞存在随机性，直接导致复孔间的 CT 值差异较大。 解决方法：如果融解曲线没有杂峰，无模板阴性对照同目的基因的 △CT 值为 3 or 5 以上，那 CT 值为准确的，可多设置
Real-time qPCR 手册——手把手教你从菜鸟到高手
或者 Premixture 里。如果反应曲线良好或已经优化好反应体系，也可以不加 ROXTM 染料校正。 通常来讲，real-time qPCR 的反应程序不需要像常规的 PCR 那样，要变性、退火、延伸 3 步。由于其产物长度在 80-150 bp 之间，所以只需要变性和退火就可以了。SYBR @Green 等染料法，最好在 PCR 扩增程序结束后，加一个溶解程序，来形成溶解曲线，判断PCR产物的特异性扩增。而溶解程序，仪器都有默认设置，或稍有不同，但都是一个在产物进行溶解时候，进行荧光信号的收集
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