白斑综合症病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

产品及特点：
白斑综合症病毒（White Spot Syndrome Virus，WSSV）与对虾肠道内微生物 群落有很大关系，在微生物群落稳定且有益微生物较多时，能维持对虾免疫力水平， 从而抑制病毒的感染。反之，微生物群落不稳定而遭到破坏时，就极易引起对虾感染 白斑病。该病通常是由水质指标(氨氮，亚盐等)恶化或偏高；天气变化、突然换料、饲 料质量差、纤毛虫病等引起的。该病的常见症状是病虾反应迟钝，空胃，不吃食，弹 跳无力，漫游池边或水面，头胸甲上有明显的针眼大小不规则的白色斑点，显微镜检 查一般为花骨朵状的，肝胰脏肿大糜烂或发红或体表发红，几天内就会有大量死亡， 对海产养殖业造成严重损害，因此白斑综合症病毒的快速准确鉴定对该病的预防和检 疫有着重要作用。本公司开发白斑综合症病毒染料法荧光定量 PCR 试剂盒，它具有下 列特点：
1. 即开即用，用户只需要提供病毒 DNA 模板。
2. 引物根据白斑综合症病毒专一区设计，特异性高。
3. 荧光定量 PCR 检测，比常规 PCR 更加灵敏。
4. 一管式闭管操作，降低了交叉污染。
5. 本试剂盒足够 50 次 20μL 反应体系的荧光定量 PCR。
6. 本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。

规格及成分：

成分	编号	小纸盒包装
2×qRT-PCR 缓冲液	试剂一	500 μL（棕色管）
荧光 PCR 专用模板稀释液	试剂二	1mL（黄盖）
白斑综合症病毒染料法 qPCR 引物混合液	试剂三	100 μL（白盖）
白斑综合症病毒染料法qPCR阳性对照（1×10E8拷贝/μL）	试剂四	50 μL（黄盖）
天净沙核酸释放剂（试用装）	试剂五	20 次（1mL，绿盖）
使用手册		一份

运输及保存：低温运输、-20℃保存，有效期一年。
自备试剂：DNA 模板、10×ROX（根据机型决定，具体见使用方法）。
使用方法：一、稀释PCR阳性对照（以 10E2-10E7 这 6 个 10 倍稀释度为例。）
1. 注意：由于阳性对照浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千
万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病
原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的 DNA 片段作为阳
性对照。
2. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
3. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液（最好用带芯枪头，下同）。
4. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照，充分震荡 1 分钟，得
1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
5. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，
充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
6. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照到 5 号管中，充分
震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
7. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
二、样品 RNA 的制备  
8. 如果有 N 个样品，必须设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性对照），
一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL PCR 阳性对照的 10000 倍稀释
的（稀释后浓度为 1×10E4 拷贝/μL，10μL 相当于 1 万拷贝，可以将 10μL 原
液加入到 990μL 自备 TE 溶液中，充分混匀，此为 100 倍稀释液。再取 10μL 此
稀释液加入到 990μL 自备 TE 溶液中，充分混匀，此为 10000 倍稀释液）再加
上一定量的水作为制备的阳性对照（加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取
决于所用试剂盒的要求）。可以用水作为制备的阴性对照。制备所得成为样品 DNA。
9. 用自选方法纯化 N+2 个样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数核酸提取试剂盒兼
容。

三、设置 qPCR反应（20μL 体系，在样品制备室进行）  
10. 如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上
步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照，6 个用于标准曲线。如果做定性
分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的
N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），1 个用于 PCR 阳性对照（用
第 4 号阳性对照稀释液，浓度为 14810 拷贝/μL）。下面只描述定量分析的步骤，
定性分析只是把 6 个标曲反应缩减成 1 个，其余不变。
11. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕
后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：

成分	N+2 个制备 所得样品	RT-PCR 阴性对照	RT-PCR 阳性 对照（2-7 管）
2×qRT-PCR 缓冲液	10μL	10μL	各 10μL
白斑综合症病毒染料法 qRT-PCR引物混合液	2μL	2μL	各 2μL
自备 10×ROX (见注)	2μL	2μL	2μL
N+2 待测样品 cDNA 模板	6μL	-	-
自备超纯水	-	6μL	-
第 7 步所得 PCR 阳性对	-	-	各 6μL（2 号样到 2 号管，3 号样到 3 号管…）

注:仅 ABI7500、7700 和 7900 仪器需要使用 ROX 作为对照，其他荧光 PCR 仪
器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene
3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX，则用水替代。
12. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR（具体 PCR 参数可以根据仪器不同而自行
优化）。
 

过程	温度	时间
预变性	95℃	5 min
PCR反应（40个循环）	95℃	15 sec
	60℃	1 min（采集SYBR通道的荧光信号）
按仪器预设程序进行熔解曲线分析

四、数据处理 
13. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵
轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 cDNA 浓度的
log 值，再推算出其浓度。
14. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等
于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于
30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则为
阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于 40 则
为阴性，如果小于 35，则为阳性。