组织钙离子浓度比色法定量检测试剂盒

钙是人体中的一种重要电介质和矿物质，占1150克。其中99％的钙以氟磷灰石钙（calcium fluorophosphate apatite）形式存在于骨组织中。非骨组织钙成分主要存在于细胞内。钙具有两种主要形式：一种是非弥散型蛋白结合钙，其构成约40％至50％的血清中的总钙含量；另一种为弥散型游离钙，其进一步分成具有活性的复合钙（complexed calcium）和离子钙（ionized calcium）。钙对神经肌肉兴奋性（neuromuscular excitability）、血液凝固、酶的激活、离子跨膜运输、释放神经传导介质、信使传导等方面起着重要作用。钙的检测包括沉淀法、EDTA鳌合滴定法、火焰光度法（flame photometry）、原子吸收分光光度法等，但容易受到钠、钾、磷酸盐、硫酸盐的干扰，或者受限于仪器的特殊的要求。Fluo-4，一种与钙离子结合，其荧光强度迅速增强100倍的荧光探针，可以敏感测定微量游离钙离子水平。在荧光分光光度仪下，激发波长485nm，散发波长520nm，来定量测定组织细胞的钙浓度。
 
产品内容

HEPENGBIO清理液（Reagent A）      毫升
HEPENGBIO裂解液（Reagent B） 毫升
HEPENGBIO反应液（Reagent C）      毫升
HEPENGBIO饱和液（Reagent D）      毫升
HEPENGBIO阴性液（Reagent E）      毫升
产品说明书    1份

保存方式

保存HEPENGBIO清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里；HEPENGBIO反应液（Reagent C）避免光照；有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于样品操作的容器
15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
DOUNCE匀浆器：用于样品制备
超声仪：用于样品制备
微型台式离心机：用于样品沉淀
培养箱：用于反应物孵育
黑色96孔板：用于样品荧光测定的容器
荧光酶标仪：用于样品荧光分析

实验步骤
 

• 样品准备

 

1. 手术取出动物组织，并秤重以确定500毫克组织重量 
2. （选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管
3. （选择步骤）加入xx毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A）清洗1次
4. 移入到一个液氮冻存管
5. 即刻放进液氮罐过夜
6. 次日从液氮罐里取出，即刻（快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）
7. 放进一个15毫升锥形离心管
8. 加入预冷的xx微升HEPENGBIO裂解液（Reagent B） 
9. 涡旋震荡5秒，充分混匀
10. 即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器
11. 在冰槽里用匀浆棒匀化组织（约20至40下）
12. （或超声处理：100瓦，10秒一次，间隔1分钟，重复3次）
13. 将所有组织匀浆物移入1.5毫升离心管
14. 转移到预冷的1.5毫升离心管
15. 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
16. 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
17. 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用HEPENGBIO Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－HEPENGBIO30030.1）
18. 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

 

• • • • 测定准备

 

1. 1. 准备好上述制备的待测样品，置于冰槽里备用
   2. 设定好荧光酶标仪（22℃）：激发波长485nm，散发波长520nm

 
三、荧光测定
 

1. 准备1个黑色96孔板，标记为：样品孔、空白对照孔、大对照空
2. 移取100微升（20微克蛋白）上述制备的样品到样品孔里
3. 移取xx微升HEPENGBIO饱和液（Reagent D）到大对照空里
4. 移取xx微升HEPENGBIO阴性液（Reagent E）到空白对照空
5. 分别加入xx微升HEPENGBIO反应液（Reagent C）到所有孔里
6. 轻轻摇动黑色96孔板，混匀
7. 室温下（22℃），孵育30分钟，避免光照
8. 即刻放进荧光酶标仪测读：获得相对荧光单位（relative fluorescence unit；RFU） 
9. 计算样品钙离子浓度：纳摩尔（注意：不要遗忘乘上稀释倍数）

注意事项
 

1. 本产品为20次操作
2. 操作时，须戴手套
3. 避免使用EDTA等处理样品
4. 孵育反应完成后即刻进行荧光测定
5. 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
6. 检测敏感度可达纳摩尔级钙浓度范围
7. 样品浓度可以按照蛋白量或组织量定