禽白血病病毒I亚群染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

产品及特点：
实时荧光定量PCR技术（Real-time Quantitative PCR，qPCR）是指在PCR反应体系中加入可与DNA产物特异性结合的荧光基团(包括荧光染料或荧光标记的特异性探针)，对PCR产物进行标记跟踪，随着PCR反应的进行，反应产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，这样即可通过荧光信号强度的变化实时监测整个PCR过程中产物量的变化，并结合相应软件对产物进行分析，可以得到荧光扩增曲线，从而计算待测样品中目的基因初始模版的量，常用于分析目的基因的表达水平的变化。它具有下列特点：
1. 一站式，用于不需要单独准备每种成分，包括引物和对照。
2. 根据禽白血病病毒I亚群的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性。
3. 基于染料法 qRT-PCR 检测，灵敏度比常规 RT-PCR 高 10-100 倍，可以达到至少1000 拷贝/反应。
4. 使用一管式 qRT-PCR 技术，RT 和 PCR 两步在一个试管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。
5. 本产品足够 50 次 20μL 体系的 RT-PCR，只能用于科研，不能用于临床。

规格及成分：

成分	编号	小纸盒包装
2×qRT-PCR 缓冲液	试剂一	500 μL（棕色管）
10×qRT-PCR 酶混合液	试剂二	100 μL（红盖）
ROX 染料 I，50×	试剂三	20 μL（棕色管）
ROX 染料 II，50×	试剂四	20 μL（棕色管）
荧光 PCR 专用模板稀释液	试剂五	1mL（黄盖）
禽白血病病毒I亚群染料法qRT-PCR 引物混合液	试剂六	100 μL（白盖）
禽白血病病毒I亚群染料法qRT-PCR阳性对照（1×10E8拷贝/μL）	试剂七	50 μL（黄盖）
使用手册		一份

运输及保存：低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。阳性对照需要因易污染其他成分需要单独放置。本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供 RNA 片段作为阳性对照。  
自备试剂：样品 RNA。
使用方法：一、稀释阳性对照（以 10E2-10E7 这 6 个 10 倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原。
1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。用带芯枪头分别加入 45 μL荧光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。
2. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(本试剂盒提供)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
3. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
4. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
二、样品 RNA 的制备  
5. 如果有 N 个样品，必须设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 上步制备的阳性对照梯度稀释液中的第 4 号（浓度为 1×10E4 拷贝/μL，10μL 相当于 10 万拷贝）再加上一定量的水作为制备的阳性对照（加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要求）。可以用水作为制备的阴性对照。
6. 用自选方法纯化 N+2 个样品的 RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA 提取试剂盒兼容。可以选购本公司的柱式病毒 RNAout。

三、设置 RT-PCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）  
7. 如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照，6 个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），1 个用于 PCR 阳性对照（用第 4 号阳性对照稀释液做模板）。下面只描述定量分析的步骤，定性分析只是把 6 个标曲反应缩减成 1 个，其余不变。
8. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后最后加）：

成分	N+2 个制备 所得样品	RT-PCR 阴性对照	RT-PCR 阳性 对照（2-7 管）
2×qRT-PCR 缓冲液	10μL	10μL	各 10μL
禽白血病病毒I亚群染料法 qRT-PCR引物混合液	2μL	2μL	各 2μL
50×ROX (见注)	0.4μL	0.4μL	各 0.4μL
样品制备所得 RNA 模板（来于第 8 步）	5.6μL	-	-
稀释所得 6 个阳性对照 （来于第 6 步）	-	-	各 5.6μL（2 号样到 2 号管， 3 号样到 3 号管…）
10×qRT-PCR 酶混合液	2μL	2μL	2μL

注:需使用 ROX 染料I的机型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus。
需使用 ROX 染料 II 的机型：：ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的 Chromo4、Opticon（II）Corbett Rotor Gene 3000。不需要使用 ROX 的机型：Thermal Cycle Dice Real Time System，LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene3000、RotorGene 6000。

9. 上机后按下面参数进行 RT-PCR（参数可能会因仪器不同而需优化）。

 

过程	温度	时间
PT（逆转录）	50℃	30 min
预变性	95℃	10 min
qPCR反应（40个循环）	95℃	15 sec
	60℃	1 min（采集SYBR通道的荧光信号）

 
四、数据处理 
10. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 RNA浓度的 log 值，再推算出其浓度。
11. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，可结合熔解曲线判断，若样品的溶解温度与阳性对照相同，该样本判断为阳性，否则为阴性。