转基因构建FMV启动子-PVY基因探针法qPCR试剂盒

转基因构建FMV启动子-PVY基因探针法qPCR试剂盒实时定量PCR：
①β-actin阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为1011，反应前取3μl按10倍稀释（加水27μl并充分混匀）为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。
②反应体系如下：
标准品反应体系
序号  反应物  剂量
1   SYBR Green 1 染料  10μl
2  阳性模板上游引物F  0.5μl
3  阳性模板下游引物R  0.5μl
4  dNTP  0.5μl
5  Taq酶  1μl
6  阳性模板DNA  5μl
7  ddH2O  32.5μl
8  总体积  50μl
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
基因反应体系：
序号  反应物  剂量
1  SYBR Green 1 染料  10μl
2  内参照上游引物F  0.5μl
3  内参照下游引物R  0.5μl
4  dNTP  0.5μl
5  Taq酶  1μl
6  待测样品cDNA  5μl
7  ddH2O  32.5μl
8  总体积  50μl
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
③制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93℃　2分钟，然后93℃ 1分钟，55℃ 2分钟，共40个循环。

PCR特异性：
1.primers design
这是重要的一步。理想的，只同目的序列两侧的单一序列而非其它序列退火的primer要符合下面一些条件：
1)足够长，18～24bp，以保证特异性，当然，不是说越长越好，太长的primer同样会降低特异性，并且降低产量；
2)GC%，40%~60%；
3)5'端和中间序列要多GC，以增加稳定性；
4)避免3'端GCrich，个BASE不要有GC，或者5个有3个不要是GC。
5)避免3'端的互补，否则，容易造成DIMER；
6)避免3'端的错配；
7)避免内部形成二级结构；
8)附加序列(RT site，Promoter sequence)加到5'端，在算Tm值时不算，但在检测互补和二级结构要加上它们；
9)使用兼并primer时，要参考密码子使用表，注意：生物偏好性，不要在3'端使用兼并primer，并使用较高的primer浓度(1μM～3μM)；
10)学会使用一种design software，PP5，Oligo6，DNA star，Vector NTI，Online design et al。
ABCB6  ATP结合蛋白家族6抗体     0.1ml
ABCF1  ATP结合盒蛋白家族GCN20F家族1抗体     0.1ml
ABCG1  三磷酸腺苷结合盒亚家族G1抗体     0.1ml
ABCG2/CD338  三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2抗体     0.1ml
KAT4  细胞周期基因1蛋白抗体     0.1ml
ABCG4  ABC膜转运蛋白抗体     0.1ml
ABCG5  三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员5抗体     0.2ml
ABCG8  三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员8抗体     0.2ml
c-Abl/Abl1  非受体酪氨酸激酶c-Abl抗体     0.1ml
phospho-c-Abl(Tyr134)  磷酸化非受体酪氨酸激酶c-Abl抗体     0.1ml
phospho-c-Abl(Tyr412)  磷酸化非受体酪氨酸激酶c-Abl抗体     0.1ml
phospho-c-Abl(Tyr245)  磷酸化非受体酪氨酸激酶c-Abl抗体     0.1ml
phospho-c-Abl(Tyr204)  磷酸化非受体酪氨酸激酶c-Abl抗体     0.1ml
phospho-c-Abl(Ser735)  磷酸化非受体酪氨酸激酶c-Abl抗体     0.1ml
phospho-c-Abl(Tyr89)  磷酸化非受体酪氨酸激酶c-Abl抗体     0.1ml
phospho-c-Abl(Tyr251)  磷酸化非受体酪氨酸激酶c-Abl抗体     0.1ml
phospho-c-Abl(Tyr272)  磷酸化非受体酪氨酸激酶c-Abl抗体     0.1ml
phospho-c-Abl(Tyr276)  磷酸化非受体酪氨酸激酶c-Abl抗体     0.1ml
SPTLC1  丝氨酸棕榈酰转移酶1抗体     0.2ml
SLC27A5  脂肪酸转运蛋白5抗体     0.2ml
Clathrin heavy chain/Clathrin HC  网格蛋白重链抗体     0.2ml
转基因构建FMV启动子-PVY基因探针法qPCR试剂盒RAB-14  RAS相关蛋白癌基因Rab14抗体     0.2ml
ARHG7  p21活化蛋白激酶ARHG7抗体     0.2ml
TdT/DNTT  末端脱氧核苷酸转移酶抗体     0.2ml
phospho-c-Abl(Thr754)  磷酸化非受体酪氨酸激酶c-Abl抗体     0.1ml
FUCA1/Alpha L fucosidase I  α-L岩藻糖苷酶抗体     0.2ml
TNFR1/TNF Receptor I  肿瘤坏死因子受体1抗体     0.1ml
HHV8/ORF K14  人类疱疹病毒8 ORF14抗体     0.2ml
SEMA6D  轴突导向因子SEMA6D抗体     0.2ml
plant lectin B4/IB4  植物凝集素IB4     0.2ml
SNX1/Sorting nexin1  分选连接蛋白1抗体     0.2ml
ERG25  甲基固醇羟化酶单加氧酶1抗体     0.2ml
phospho-c-Abl(Tyr283)  磷酸化非受体酪氨酸激酶c-Abl抗体     0.1ml
Cytosine deaminase  胞嘧啶脱氨酶抗体     0.2ml
SQSTM1/p62  泛素结合蛋白P62抗体     0.2ml
NFAT4  核因子活化T细胞胞浆蛋白3抗体     0.2ml
Exportin 1/CRM1  染色体区域稳定蛋白/核输出蛋白1/染色体区域稳定必需蛋白抗体     0.1ml
IKZF3  锌指蛋白Aiolos抗体     0.2ml
C3a Receptor/C3aR  过敏毒素C3受体/补体C3受体抗体     0.2ml
Alpha-ENaC  钠通道蛋白α ENaC     0.2ml
PLAGL2  多形性腺瘤基因样蛋白2抗体     0.2ml
5HTR2C  5-羟色胺受体2C抗体     0.2ml
ROM-K/KCNJ1  ATP调节钾离子通道ROM K抗体     0.2ml
Calsequestrin  肌钙集蛋白/收钙素抗体     0.2ml
Syncytin 1/HERV  合胞素1抗体     0.2ml
TASK 3/KCNK9  酸敏感性钾离子通道蛋白抗体     0.2ml
TSLP  胸腺基质淋巴细胞生成素-1抗体     0.1ml
Myosin-XVIIIb  肌球蛋白XVIIIb抗体     0.2ml
RBPJK/RBP-J  Notch转录调控蛋白RBPJK抗体     0.2ml
Maltose Binding Protein/MBP  麦芽糖结合蛋白抗体     0.2ml
HPV33 E6  人类乳头状瘤病毒33抗体     0.2ml
HPV33 E7  人类乳头状瘤病毒33抗体     0.2ml
PHGDH  磷酸甘油酸脱氢酶抗体     0.2ml
实验注意事项：
1）RT-PCR可以检测组织、细胞、血液、细菌等很多材料，不同的样本有不同要求，实验前请充分沟通确认实验方案和样本情况；
2）客户尽可能提供实验的背景信息、物种、基因准确的名称和ID号；
3）客户尽量不要提供DNA或RNA样品。
4）样本保存于液氮或干冰，也可以保存于Trizol液中。
实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR的化学原理包括探针类和非探针类两类，探针类是利用与靶细胞序列特异性杂交的探针来指示扩增产物的增加，非探针类是利用荧光染料或者特异性设计的引物来指示扩增的增加。运用该技术可以对DNA、RNA样品进行定量（包括绝对定量和相对定量）和定性分析。 主要服务：DNA或RNA的绝对定量分析、基因表达差异分析、基因分型。
主要技术：引物设计、RNA提取、cDNA合成、qPCR。