流式单标细胞实验

一、实验原理与核心价值

流式单标实验基于荧光标记抗体与目标抗原的特异性结合，通过流式细胞仪检测单个细胞的荧光信号强度，实现目标分子表达水平的定量分析。其核心优势包括：

• 单细胞分辨率：可检测异质群体中不同亚群的表达差异；
• 高灵敏度：最小检测限可达每个细胞几十个抗原分子；
• 动态范围广：荧光强度与抗原表达量呈线性关系，覆盖3-4个数量级。

---

二、标准化实验流程（以细胞表面抗原检测为例）

1. 实验前准备

步骤	关键参数	技术细节
细胞样本制备	- 天然单细胞悬液（血液/骨髓）：直接裂解红细胞后离心（300×g，5 min） - 贴壁细胞：胰酶消化（0.25% Trypsin-EDTA，37℃ 3 min）后过筛（40 μm尼龙网） - 实体组织：机械研磨+胶原酶IV（1 mg/ml，37℃ 30 min）	活率需>90%（台盼蓝染色验证），浓度调整至5×10⁵-1×10⁷/mL
抗体选择与稀释	- 荧光素：FITC（高表达抗原）、PE（中等表达）、APC（低表达） - 稀释梯度：预实验确定最佳浓度（通常1:100-1:200）	避免使用同型对照抗体批次差异，推荐使用已验证的商业化抗体
仪器校准	- 光路校准：每日使用标准荧光微球（如BD Calibrite）调整PMT电压 - 阈值设定：FSC > 5×10³排除碎片	确保前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）增益一致

2. 核心操作步骤

1. 细胞染色

   • 直接法：加入荧光标记一抗（5 μL/10⁶细胞），避光孵育30 min（4℃）；
   • 间接法：一抗孵育后，加入荧光标记二抗（如Goat Anti-Mouse IgG-FITC）。
     关键控制点：洗涤3次（PBS + 2% FBS）去除未结合抗体。

2. 上机检测

   • 进样速度：低速模式（<1000 events/sec）确保单细胞通过；
   • 数据采集：至少收集10,000个细胞事件。

3. 对照设置

   对照类型	目的	操作要求
   阴性对照	确定背景荧光水平	未染色细胞或同型对照抗体
   阳性对照	验证抗体有效性	已知表达目标抗原的细胞系（如Jurkat CD3+）
   死活细胞对照	排除死细胞非特异性结合	7-AAD或PI染色（终浓度1 μg/mL）

---

三、数据解析与结果呈现

1. 图形化分析

• 直方图（Histogram） ：X轴为荧光强度（Log scale），Y轴为细胞数量，通过峰分离判断阳性群体比例；
• 散点图（Dot Plot） ：FSC vs SSC初步分选细胞亚群，再叠加荧光信号。
  示例：CD4+ T细胞检测中，阳性群体会在FITC通道形成明显右移峰。

2. 定量指标计算

• 阳性率（% Positive） ：MFI（Median Fluorescence Intensity）> 同型对照MFI+2SD的细胞比例；
• 表达强度：ΔMFI = 实验组MFI - 阴性对照MFI。