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Sephadex LH-20的分离原理是根据分子大小的不同进行分离。主要有凝胶过滤作用和反相分配作用。1）使用凝胶过滤作用，大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。2）使用反相分配作用，使用反相溶剂洗脱，极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。
Sephadex LH-20尤其适用于天然产物在有机溶剂中的纯化。例如：类固醇、萜类、脂类以及小分子多肽等，Sephadex LH-20同时适用于分子类别非常相似的物质的分离和工业规模的制备，既可用于初步纯化步骤，也可用于最终精制步骤，如非对映同分异构体的分离。
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