Cy3-ChromPure Human IgG, whole

Jackson ImmunoResearch公司二抗选用指南

亲和层析法纯化的二抗

用亲和层析法纯化的抗体是指，利用耦联到琼脂糖凝胶上的抗原将抗血清中的抗体亲和层析下来。我们采用一种特有的连续的洗脱过程将抗体从固态抗原上分离出来。我们提供的未标记的亲和层析法纯化的抗体是不含有稳定剂和防腐剂的无菌液体。耦联标记物的抗体是冻干粉，里面含有稳定剂和防腐剂，但是过氧化物酶标记的抗体里面不含防腐剂。

亲和层析纯化抗体的选择和定位

第一步:选择Whole IgG、F(ab')2片段，或者Fab片段抗体。

我们提供三种亲和纯化的抗体：Whole IgG，F(ab’)2 片段，Fab 片段。

Whole IgG抗体

是从抗血清中分离出来的完整的分子。这些抗体有一个 Fc 部分和两个与抗原结合的 Fab 部分，因此是二价的。Whole IgG抗体适用于多数情况，也是性价比ZUI高的。

F(ab')2 片段抗体

是用胃蛋白酶消化 IgG 去除 Fc 部分，剩下两个靠二硫键连接的结合抗原的 Fab 部分（依然是二价的）。这些抗体用在特定的情况中，例如避免抗体与 Protain A 或 G结合，或者与有 Fc 受体的活细胞结合。但是，如果一抗是 whole IgG，不管二抗是哪种形式都可能出现结合 Fc 受体。这时，为了阻止抗体结合到 Fc 受体上，可以在 4 度将细胞预培养于含有叠dan钠和二抗来源物种正常血清的缓冲液中。
     
注意：当使用的是带标记的二抗时，千万不能用一抗来源物种的正常血清和 IgG 来封闭。如果血
清中的免疫球蛋白非特异性的结合到样品上，他们会被带有标记的二抗识别，导致背景过高。

Fab 片段抗体

是用木瓜蛋白酶消化 IgG 后得到的。这些抗体只含有一个结合位点。它们用来封闭内源性的免疫球蛋白，或者在使用相同物种来源的一抗作多标记的实验中，用于封闭暴露的免疫球蛋白。

第二步:在左边标记“antibody description”的拦里找到一抗的物种来源。

抗体是根据一抗的物种来源的字母表顺序排列。比如，如果一抗是小鼠来源的，就找“ anti- mouse”。
说明：目录中提供了抗叙利亚仓鼠和抗亚美尼亚仓鼠的抗体。为了正确的选择二抗，必须知道一抗是在哪种仓鼠中制备的。

第三步：在“antibody description”下选择二抗的物种来源。

物种来源在 antibody description栏的开头。

第四步：再 antibody description下面选择二抗的特异性。

     注意：不同来源的免疫球蛋白含有相似的结构，抗体的生成过程也相似。抗一个物种的抗体可能与其他物种发生交叉反应，除非事先特殊处理过－这时会标有“(min X …Sr Pro。t)
ML（multiple labeling）。

下面词语的解释将对选择合适的抗体有所帮助。

Anti-IgG (H+L)

这类抗体和 IgG 分子的重链和轻链都可以反应，比如，和 IgG 分子的 Fc，F(ab’)2/Fab 部分。AntiIgG (H+L)抗体也可以和其他的免疫球蛋白家族反应（比如 IgM 和 IgA），因为所有的免疫球蛋白都有相同的轻链（或者κ 链，或者λ 链）。Anti-IgG (H+L)抗体比只抗片段的抗体识别更多的抗原表位。

Anti-IgG，Fc fragment specific

这类抗体和 IgG 重链的 Fc 部分反应。它们通过了 ELISA 检测，和/或针对 Fab 片段吸附的测试。某些情况下，这类抗体需要额外检测和处理来降低和 IgM 或 IgA 的交叉反应。在这种情况下（anti- human,-mouse,-rat），它们会被描述为“Anti-IgG, Fcγ fragment specific”。
     注意：不是所有 anti-IgG, Fc抗体和所有亚型的 IgG 反应能力一致。要找和四种 IgG 亚类反应能力差不多的 anti-mouse IgG, Fcγ 抗体的话，应当选 Goat Anti-Mouse IgG(subclasses 1+2a+2b+3), Fγc fragment specific (min X Hu,Bov,Rb Sr Prot)

Anti-IgG，Fcγ Subclass specific

这类抗体分别和不同的小鼠 IgG 亚型重链的 Fc 部分反应。它们经过 ELISA 和/或针对 Fab 片段、IgM 和其他小鼠 IgG 亚型的吸附测试。

Anti-IgG，F(ab’)2 fragment specific

这类抗体和 IgG 的 F(ab’)2/Fab 部分反应。它们经过了 ELISA 和/或 Fc 片段的吸附检测。因为它们是和轻链反应，它们同时也和具有相同轻链的其他种类的免疫球蛋白反应（如 IgM 和 IgA）。

(min X…Sr Prot)

这类抗体经过了检测以及针对 IgG 和圆括号中的物种的血清蛋白的吸附处理 当其他物种免疫球的抗体时，要特别注意，因为它们能识别的表位数量大大减小了，可能识别单抗的能力很弱。这种情况的例子有 Anti-Mouse IgG (min X Rat,….Sr Prot), A-Rntait IgG (minm X Mouse, …Sr Pro和t), Anti-Ramenian Hamster IgG (min X Mouse, Rat, …Sr Pr参见ot).  ML（Multiple Labeling）。

ML （Multiple Labeling）

有些抗体标明了 ML，来强调它们除了可以用于单标，还可用于多标记实验。
     注意：除非特别处理过，针对一个物种的二抗可能和很多其他物种有交叉反应。
在选择二抗时，只有在来自两个很相近的物种的一抗都存在而需要检测其中一种时，才使用针对其中一种特殊吸附处理过的抗体。这样的抗体可能不能和所有亚型的 IgG 都很好的反应。比如，在含有内源性免疫球蛋白的大鼠的组织样本中，使用针对大鼠吸附处理过的 anti-mouse IgG来检测小鼠的一抗，或者在多标记实验中使用了大鼠的一抗时。当不含有大鼠免疫球蛋白时，最好采用没有针对大鼠 IgG 处理过的 anti-mouse 二抗来检测小鼠的一抗。

牛血清白蛋白（BSA）和奶粉中可能含有牛 IgG。直接针对牛，山羊，马和绵羊的二抗会跟牛 IgG反应。因此，使用 BSA 或者奶粉来封闭或者稀释这些抗体可能导致背景染色明显增加，以及抗体效价的降低。这时，推荐使用 5％的二抗来源物种的正常血清来封闭。

第五步：从表格顶部选择需要的探针。

第六步：在 antibody description一行和探针栏相交处，找到选择的抗体的价钱、规格和目录号。
每个方格顶部的数字时每个单位的价钱，底部的 9 位数字为目录号。 第七步：在定购前完成产品说明。为了避免错误，产品说明应该遵循一个特定的语法排列。比如，目录号为 115－096－072 的产品应当描述为：

A. 耦联的探针。如果没有耦联，不用写。
C. 二抗的来源物种名称。
D 和该抗体反应的物种名称。
E. 抗体特异性描述。
F. 经过吸附处理以后减小了交叉反应的物种名称。
            使用带标记的二抗进行多标记（ML）实验
同时检测一个以上的抗原至少依赖两个重要标准：
1. 有如下的二抗：a. 不相互识别（来源于相同的物种），b. 不识别实验系统中其他的一抗，c.不识别实验系统中其他物种的免疫球蛋白，d. 不识别样品中内源性的免疫球蛋白。
2. 探针的使用是被很好的验证过的（酶反应产物，荧光团，或者电子密度颗粒）。亲和层析法纯化的标有 ML 的抗体都是针对上面的标准来特别制备的。下面这个例子是众多应用这些试剂进行多标记实验的实验步骤中的一个。
                          耦联到亲和层析纯化的抗体和其他蛋白上的探针
A. 仪器。比如，光源，滤片，检测系统。
B. 多标记中对色彩区分程度的要求。比如，若丹明红-X (RRX)和德克萨斯红(TR)荧光素的区别就比和四甲基若丹明（TRITC）或者 Cy3 的区别明显。
C. 要求的灵敏度。比如，Cy3 和 Cy5 就必其他的荧光团要亮。
Aminomethylcoumarin Acetate (AMCA)

耦联的 AMCA 吸收光波长最大为 350nm，发荧光的则为 450nm。对于荧光显微镜来说，AMCA 可以用汞灯来激发，用紫外滤板来观察。由于人眼不能很好的检测蓝色荧光，在多标记的实验中，AMCA 耦联的二抗应当被用于检测大量的抗原。改善 AMCA 可视性的方法包括增强眼睛对黑暗的适应力，使用氟石代替玻璃物品，避免吸收 UV 的介质（如塑料），以及照相。AMCA 和荧光素一样很快淬灭，因此要和抗淬灭剂一起使用。
如果使用在流式细胞仪中，AMCA 可以用汞灯或者水冷却的氩光灯激发，因为它们发出的光线是在光谱的紫外区。

由于 AMCA 和荧光素的荧光波长只有很小的重叠范围，而和发出长波长荧光的荧光基团没有或者只有极少的重叠，因此它最常用于多标记实验中，比如免疫荧光显微镜和流式细胞仪。由于它相对较弱的信号，单标实验中不推荐使用 AMCA。

luorescein Isothiocyanate (FITC)

耦联的荧光素基团吸收的最大波长为 492nm，发射的最大波长为 520nm。由于被使用了很长时间而且产量很大，FITC 是被广泛应用的荧光基团。荧光素的最大缺点是淬灭快，使用抗淬灭剂可以减轻。FITC 是这个产品目录中使用最多的耦联基团。

DTAF 是荧光素的另一个衍生物，激发和发射波长均和 FITC 相同。当和链霉亲合素耦联时，因为荧光强度上有明显的区别，最好使用 DTAF，而不是 FITC。

Cyanine dyes（Cy2, Cy3, Cy2 耦联基团激发波长为 492nm，发光为波长 510nm 的绿色可见光。Cy2 比 FITC 在光下更稳定，
对 pH 的变化不那么敏感，在有机封片剂中发出更多的荧光。因此，在表面荧光显微镜下， Cy2 可
以被观察更长的时间，而且比 FITC 荧光更强。Cy2 和 FITC 使用相同的滤波片。
注意：
要避免使用含有磷酸化的苯二胺的封片剂，因为这种抗淬灭剂和 Cy2 反应，在染色片储存后会导致荧光微弱和扩散。

Cy3 和 Cy5 比大多说荧光基团更亮，更稳定，背景更弱。Cy3 耦联基团激发光的最大波长为550nm，最强发射光为 570nm。在荧光显微镜中，它们可以使用和 TRITC 一样的滤波片，因为激发光和发射光波长于 TRITC 很接近。（546nm）下则约 75％。Cy3 可以和荧光素一起作双标。但是，为减小 Cy3 的荧光，观察荧光素推荐使用 FITC 滤光片中的窄带发射片。Cy3 还可以和 Cy5 一起在共聚焦显微镜实验中作多标记。

Cy5耦联基团的激发波长最大 650nm，发光波长最大 670nm。在氪氩灯（647nm）下它们可被激发出 98％的荧光，在氦氖灯下（633nm）为 63％。由于 Cy5 比其他的短波长发射光的荧光基团具有更宽的发射光范围，因此它可以和很多其他的荧光基团一起用在多标记的实验中。和其他荧光基团相比，Cy5 最大的优势在于生物样品在这个波段自发的荧光很低。但是，由于它的最大发射波长在670nm，Cy5 很难用裸眼观察，而且不能用汞灯作理想的激发。因此，使用传统的表面荧光显微镜时，不推荐使用 Cy5。通常观察 Cy5 时采用具有合适激发光和远红外检测器的共聚焦显微镜。

尽管在表面荧光显微镜上观测 Cy 染料通常不要求使用抗淬灭剂，在共聚焦激光扫描显微镜的水相封片剂中应当加入抗淬灭剂。用 Cy2 标记的样品要避免含有磷酸化的苯二胺的封片剂，因为这种抗淬灭剂会和 Cy2 反应。其他的抗淬灭剂，比如 n-propyl gallate，可以添加到染料染色部分的水相介质中。有机的封片剂，比如 DPX 或者甲基水杨酸，也可和 Cy 染料一起使用。

Tetramethyl Rhodamin Isothiocyanate（TRITC）, Rhodamine Red-X (RRX), Texas Red (TR)
这些若丹明的衍生物耦联基团具有不同的吸收波长 (550, 570, 596nm和) 最大发射波长（570, 590, 620nm）。尽管 TRITC 经常和 FITC 一起在双标记实验中使用，使用 RRX 和 TR 可以得到更好的颜色区分。但是，有报道指出使用 TR 可能导致高背景染色。
在使用装有氪氩灯的激光共聚焦扫描显微镜作三标记的实验时， RRX 尤其有用，可以和 Cy2(或者FITC)和 Cy5 一起使用，因为 RRX 的发射波长在 Cy2 和 Cy5 中间，而且和这两者覆盖都很少。氪氩灯激发光为 488nm，598nm 和 647nm，分别是 Cy2(FITC), RRX和 Cy5 的理想激发波长。

在流式细胞仪中用 FITC 作双标，另一种用藻红蛋白（PE）耦联基团要比若丹明好，这是因为FITC 和 PE 可以被氩灯的 488nm 波长激发。

Biotin-SP (长连接的)

Biotin-SP 是我们用来命名和其耦联蛋白之间具有长连接的生物素。在使用 Biotin-SP 耦联的抗体作酶免疫实验时，相比没有长连接的生物素标记的抗体，灵敏度有很明显的提高。在 Biotin-SP 耦联的抗体和碱性磷酸脂酶耦联的链霉亲合素共同作用时，这种优势尤为明显。很明显，这个长连接将生物素从蛋白表面延伸出去，降低了空间阻碍。

生物素耦联的抗体需要另外的试剂来显色。本目录提供了链霉亲合素和抗生物素，都耦联了探针。

酶

我们提供两种不同的酶耦联物：辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸脂酶。
HRP 耦联物是通过 Nakane 和 Kawaoi 过程制备的。过氧化物酶耦联物广泛应用于免疫组化，Western blotting和 ELISA 中。

碱性磷酸脂酶耦联物是通过优化过的 Avremeas 方法制备的，是复合物，具有高有效浓度和高分子量。它们比较灵敏，适合于固相的免疫检测实验比如ELISA和Western blttingo

尽管碱性磷酸脂酶已经被应用于免疫组化，但是组织的渗透能力会受到其体积的影响。   
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