96孔板测定示例
概述
准备含有HDAC的样品(40μL)
添加HDAC抑制剂或测试化合物(10μL)
在室温或37℃孵育10-20分钟
添加HDAC Green 底物工作溶液(50μL)
在室温或37℃下孵育30-60分钟
监测Ex / Em = 490 / 525nm处的荧光强度
注意:在开始实验之前解冻所有试剂盒组分。
操作方法
1.准备工作解决方案:
1.1制备含有HDAC的测试样品:在测定缓冲液(组分B)中以1:40稀释5-10mg / mL HeLa核提取物或细胞裂解物。
注意:40μL稀释样品足以用于96孔板的一个孔。 使用前立即稀释提取物。 将溶液储存在冰上。
1.2制备HDAC抑制剂(Trichostain A)溶液的稀释液:在测定缓冲液(组分B)中以1:100稀释3mM曲古菌素A溶液(组分C),得到30μM曲古抑菌素A溶液。向每个抑制剂对照孔中加入10μL30μM曲古抑菌素A溶液。
1.3制备HDAC Green 底物工作溶液:将20μLHDACGreen 底物(组分A)和100μL信号增强剂(组分D)加入5 mL测定缓冲液(组分B)中。
注意1:稀释的HDAC Green 底物工作溶液不稳定,5 mL稀释的HDAC Green 底物工作溶液足以进行100次分析。
注意2:为每个实验准备新鲜的HDAC Green 底物工作溶液。 将重构的工作溶液保存在冰上直至使用。
2.运行HDAC分析:
2.1将40μL稀释的核提取物,酶溶液或其他HDAC样品和10μL测试化合物加入相应的微孔板孔中(参见说明书中的表1)。
对于阳性对照:用10μL测定缓冲液(组分B)加入40μL稀释的HDAC酶溶液或HeLa核提取物(来自步骤1.1)。
对于阴性对照:添加40μL稀释的HeLa核提取物(来自步骤1.1)和10μL30μM曲古抑菌素A溶液(来自步骤1.2),或使用不含HDAC活性的已知样品。
对于空白(无酶):仅添加50μL测定缓冲液(组分B)。
2.2将板在室温或37℃下孵育10-20分钟。
注意:为了筛选HDAC抑制剂,在添加HDAC Green 底物工作溶液之前,先用HeLa核提取物或纯酶预孵育这些化合物(参见步骤2.3)
2.3将50μLHDACGreen 底物工作溶液(来自步骤1.3)加入每个孔中。 将板在室温或37℃孵育30-60分钟。
2.4 Ex / Em = 490 / 525nm时的监测荧光强度。