Bend.3小鼠脑微血管内皮细胞株丨逸漠(immocell)

细胞介绍

细胞转染了表达多瘤病毒中T抗原的NTKmT逆转录病毒载体。

细胞特性

1) 来源：BALB/c小鼠脑

2) 形态：内皮细胞样

3) 含量：>1x106 个/mL

4) 污染：支原体、细菌、酵母和真菌检测为阴性

5) 规格：T25瓶或者1mL冻存管包装

运输和保存

可选择干冰运输及发送复苏存活细胞方式

(1)干冰运输，收到后立即转入液氮或者-80度冰箱冻存或直接复苏;

(2)存活细胞，收到后应继续生长，传代达到细胞生长状态良好时，再进行冻存。具体操作见细胞培养步骤。

(3)收到细胞后请拍照，3天内如果发现污染，请及时拍照与我们联系。

细胞用途：仅供科研使用。

细胞接收后的处理：

1) 收到细胞后，请检查发货培养瓶的状况，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请拍照后及时联系我们。

2) 在显微镜下确认细胞生长状态时，最好在低倍镜(4或5X物镜)下进行，能准确判断细胞的传代密度。看细胞的形态请在10X和20×物镜下，同时给刚收到的细胞拍照，(10×，20×)各2-3张以及培养瓶外观照片一张留存，作为细胞需要售后时提供收到细胞时细胞状态的依据。

3) 观察好细胞状态后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h。

4) 贴壁细胞：在运输过程中贴壁细胞会有脱落的现象，如发现贴壁细胞有脱落或者脱落后抱团生长，可将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，然后抽出瓶中的培养基和未贴壁细胞1000rpm离心5分钟，弃去上清重悬后接种到加有按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基的原培养瓶中(或新的培养瓶中)。

5) 悬浮细胞：T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，然后抽出瓶中的培养基和细胞1000rpm离心5分钟，弃去上清重悬后接种到新的培养瓶中(加入按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基)。

6)备注：运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。 收到细胞后第一次传代建议1：2传代 。

细胞培养步骤

一.培养基及培养冻存条件准备：

1) 准备DMEM 培养基，优质胎牛血清，10%，双抗 1%。

注意：(培养条件说明：bEnd.3细胞对培养基pH的任何不平衡都很敏感。如果您使用含有3.7 g / L碳酸氢钠的DMEM培养基配方，细胞必须在95%的空气中培养; 10%二氧化碳(CO 2)环境。当使用3.7g / L碳酸氢盐以使培养基适当缓冲时，增加的CO2是必要的，否则这些细胞不会很好地附着或增殖。如果使用仅含1.5 g / L碳酸氢钠C DMEM培养基，则该培养基配制成与5%二氧化碳(CO 2)一起使用。基础培养基应当补充有10%非热灭活的胎牛血清(FBS))

2) 培养条件： 气相：空气，95%;二氧化碳，5%。 温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3) 冻存液：90%FBS，10%DMSO，现用现配。

二. 细胞处理：

1) 复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜)。第二天换液并检查细胞密度。

2) 细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2. 加2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3. 按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4. 收到细胞后首次传代推荐将细胞悬液按1：2的比例分到新的含6ml培养基的新皿中或者瓶中，建议冻存一支备用，后续传代根据实际情况按1:2到1:5的比例进行。

3)细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为类;

1，细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml完全培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2，4min 1000rpm 离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度1-2xE6/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3，将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。