Protein A/G免疫沉淀磁珠试剂盒

细胞生物学研究有以下几个方面。
细胞生物学的研究内容十分广泛,主要包括。
①细胞核、染色体以及基因表达的研究。
②生物膜与细胞器的研究。
③细胞骨架体系的研究。
④细胞增殖及其调控。
⑤细胞分化及其调控。
⑥细胞的衰老与编程性死亡(凋亡)。
⑦细胞的起源与进化。
⑧细胞工程。
中文名称：Protein A/G免疫沉淀磁珠试剂盒
英文名称：Protein A/G Immunoprecipitation Kit
产品规格：20次/100次
发货周期：1～3天
产品简介：
Protein A/G Matrix免疫沉淀磁珠及试剂盒系列产品是利用纳米表面技术使Protein A/G高密度定向包被到超顺磁性微球表面，与当前国际免疫磁珠市场上同类产品相比，该产品具有更多的抗体结合位点，磁珠使用量更少，非特异性结合率低，可便捷高效地进行免疫沉淀实验。每毫升免疫沉淀磁珠结合Human IgG的能力可达到300 μg以上，单个沉淀反应仅需25 μL磁珠即可完成检测。微米级磁珠提供的超大比表面积，大幅缩短抗体与抗原吸附所需的平衡时间，15 min内即可完成抗体吸附过程，30 min内完成抗原沉淀操作。简短的操作时间避免长时间操作造成目标蛋白水解，保证了目标蛋白的活性及蛋白复合物的完整性。
免疫沉淀磁珠试剂盒配有经过优化预制的缓冲液，为免疫沉淀实验提供了最佳的反应条件，增强了免疫沉淀实验的稳定性。
本产品可广泛应用于细胞裂解物、细胞分泌上清、血清、腹水等样品中抗原的免疫沉淀反应。操作者可以参考本操作说明书，附表1的数据了解不同种属来源及亚型的抗体与Protein A磁珠、Protein A/G的结合能力。
储存条件：2～8℃保存
保存期：1年
注：磁珠结合Human IgG能力(Antibody Capacity)分别为：Protein A：0.4～0.5 mg/mL; Protein A/G：0.5～0.6 mg/mL
操作流程：
1. 抗原样品制备：本操作说明书提供以下四种样品处理方法，建议您根据不同来源的抗原样品选择适当的方式进行预处理，使待检测抗原释放至样品溶液中。
血清样品处理：若目标蛋白丰度较高，建议用结合缓冲液(②)稀释血清样品至目标蛋白终浓度为10～100 μg/mL，置于冰上备用(或置于-20℃长期保存)。
悬浮细胞样品处理：离心收集细胞(4℃，500 g，10 min)，弃上清后称重，按每毫克细胞50 μL的比例用1× PBS(③)洗涤2次；按每毫克细胞5～10 μL 的比例加入结合缓冲液(②)，同时加入蛋白酶抑制剂(如终浓度为1 mM 的PMSF)，混匀后置于冰上处理10 min；离心收集上清液(4℃,14000 g,10 min)，置于冰上备用(或置于-20℃长期保存)。
贴壁细胞样品处理：移去培养基，按每1.0×105个细胞150 μL的比例用1×PBS(③)洗涤两次；用细胞刮棒刮脱细胞，收集至1.5 mL EP管内，按每1.0×105个细胞20～30 μL 的比例加入结合缓冲液(②)，同时加入蛋白酶抑制剂(如终浓度为1 mM的PMSF)，混匀后置于冰上处理10 min；离心收集上清液(4℃，14000 g，10 min)，置于冰上备用(或置于-20℃长期保存)。
大肠杆菌样品处理：离心收集大肠杆菌(4℃，12000 g，2 min)，弃上清后称重，按每克(湿重)菌体 10 mL的比例用1×PBS(③)洗涤2次；按每克(湿重)菌体5～10 mL的比例加入结合缓冲液(②)，同时加入蛋白酶抑制剂(如终浓度为1 mM 的PMSF)，重悬菌体，超声裂解细胞，离心收集上清(4℃，17000 g，10 min)。
2. 磁珠预处理：将免疫沉淀磁珠(①)漩涡振荡1 min，使磁珠充分振荡重悬；取25～50 μL磁珠悬液置 于1.5 mL EP管中。加入200 μL 结合缓冲液(②)洗涤，进行磁性分离［将EP管放置于磁性分离器(⑦)上，使磁珠被吸附在管壁至溶液澄清；该操作描述以下省略］，弃上清液，从磁性分离器上取下EP管，重复洗涤一次。最后加入200 μL 结合缓冲液(②)重悬磁珠以备用。
3. 抗体结合反应：
抗体工作液的制备：用结合缓冲液(②)稀释抗体样品，配制成终浓度为5～50 μg/mL抗体工作液，置于冰上备用。
抗体吸附：将步骤2预处理的磁珠悬液进行磁性分离，弃上清液；加入200 μL抗体工作液，迅速重悬后在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转EP管，15 min后进行磁性分离，收集上清液置于冰上以备后续检测。
洗涤：向EP管中加入200 μL 结合缓冲液(②)洗涤，用移液器轻轻吹打使磁珠-抗体复合物均匀分散，然后进行磁性分离，弃上清液，从磁性分离器上取下EP管。重复以上洗涤操作一次。
4. 抗体交联反应 (备选)：如操作者需要将抗体和目标抗原复合物共同洗脱，请忽略本步骤，进行步骤5。
本步骤适用于操作者需要单独洗脱目标抗原的试验，推荐使用BS3(Thermo Scientific，Cat. #21580)作为交联剂，相关实验请参照该试剂的操作说明。
5. 抗原沉淀反应
抗原吸附：加入200 μL步骤1中制备的抗原样品，用移液器轻轻吹打使抗原与磁珠-抗体复合物均匀分散。在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转EP管10 min，使抗原与抗体充分结合，如结合力较弱则可在室温下反应1 h或者在4℃下反应过夜。
洗涤与转移：将上述完成抗原吸附的磁珠-抗体-抗原复合物进行磁性分离，收集上清液置于冰上以备后续检测。向EP管中加入200 μL洗涤缓冲液(④)洗涤，用移液器轻轻吹打使磁珠-抗体-抗原复合物均匀分散，然后进行磁性分离，弃上清液；从磁性分离器上取下EP管，再重复洗涤两次。最后加入200 μL 洗涤缓冲液(④)，用移液器将磁珠-抗体-抗原复合物悬液转移至新的1.5 mL EP管中*，并执行磁性分离，移弃上清。
(*注：抗原洗脱前务必将磁珠转移到新的EP管，避免将管壁上原有的非特异性吸附蛋白一起洗脱。)
6. 抗原洗脱：本操作说明书提供以下两种抗原洗脱方案，操作者可根据后期检测的需要选择不同的抗原洗脱方法。
变性洗脱法：此法洗脱的样品适用于SDS-PAGE检测。从磁性分离器上取下EP管，向其中加入25 μL 1×SDS-PAGE Loading Buffer(自备)混合均匀，95℃加热5 min。然后执行磁性分离［也可以使用离心的方式(室温下13000 g，10 min)］收集上清液进行SDS-PAGE检测。
非变性洗脱法：此方法洗脱的样品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析。从磁性分离器上取下EP管，向其中加入20 μL洗脱缓冲液(⑤)混合均匀，室温孵育10 min。然后执行磁性分离［也可以使用离心的方式(4℃，13000 g,10 min)］，收集上清液至新的EP管，并立即加入1.0 μL中和缓冲液(⑥)将洗脱产物pH调节至中性，用于后期功能分析。
注意事项：
1. 进行免疫沉淀操作之前，请务必认真阅读本操作说明书。
2. 本产品须与磁性分离器配套使用。
3. 磁珠使用前应充分振荡均匀。
4. 磁珠应保存在储存溶液中，防止干燥。
5. 请勿将磁珠冷冻或离心，以免引起不可逆聚集。
6. 10×PBS(③)应在无菌条件下稀释，一旦发现溶液有污染情况，请停止使用该溶液。
7. 为保证最佳的实验结果，请选择特异性较强的抗体进行免疫沉淀反应。
8. 操作者可根据实际需求，利用抗体结合反应步骤以及抗原结合反应步骤中收集的上清液检测抗体、抗原 和磁珠的结合情况。
9. 对于IP实验，不同类型的抗体与抗原结合的亲和性是有区别的，抗体与抗原结合还会受到结合缓冲液和洗涤缓冲液的影响，因此，如果操作者使用本试剂盒提供的缓冲体系不能获得很好的实验结 果，可自行筛选及配制缓冲液进行实验。
10. 本磁珠表面包被的重组蛋白Protein A/G在极端条件下(如低pH、加热处理)存在极低的蛋白脱落情 况，但仍然不建议操作者用于分子量约130 kD目标蛋白的免疫沉淀实验。
11. 本产品仅供研究使用。
注意事项：
    Protein A/G免疫沉淀磁珠试剂盒 尽管经测试Annexin V-FITC反复冻融5次对于其检测效果无显著影响，但为取得良好的使用效果，3-6个月内推荐4℃保存，并适当注意避免反复冻融。
      如果有细菌或真菌污染，会严重影响检测效果。
      染色后宜尽快检测，时间过长可能会导致凋亡或坏死细胞的数量增加。
      如果细胞收集过程中使用了胰酶，需注意设法去除残留的胰酶。残留的胰酶会消化并降解Annexin V-FITC，导致染色失败。
      荧光物质均易发生淬灭，在进行荧光观察时，尽量缩短观察时间，同时在操作和存放过程中也尽量注意避光保存。
      用于流式细胞仪检测时，如果发现Annexin V-FITC单独染色时出现了过多的PI假阳性细胞，并且通过调整相关设置和参数也无法改善，可以用PBS将Annexin V-FITC稀释3-10倍后再进行检测，这样通常可以有效减少假阳性的坏死细胞。
      需自备PBS。
      本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
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细胞培养的优点：
1.研究的对象是活细胞
在实验过程中，根据要求可始终保持细胞活力，并可长时间监控、检测甚至定量评估一部分活细胞的情况，包括活细胞的形态、结构、生命活动等。
2.研究条件可以人为控制
pH、温度、氧气、二氧化碳、张力等物理化学的条件，可以根据实际需要进行人为的控制，同时，可以施加化学、物理、生物等因素作为条件而进行实验观察，这些因素同样可以处于严格控制之下。
3.研究的样本可以达到比较均一性
通过细胞培养一定代数后，所得到的细胞系则可以达到均一性而属于同一类型的细胞，需要时，可采用克隆化等方法使细胞达到纯化。
4.研究内容便于观察、检测和记录
采用各种研究技术：如倒置生物显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、流式细胞术、激光共焦显微镜、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记等各种仪器设备。