RIPA裂解液(中) RIPA Lysis Buffer (

RIPA裂解液(中) RIPA Lysis Buffer (Medium)

产品简介

多种成分均可以从细胞中提取总蛋白，如Triton、SDS、NP-40等。RIPA裂解液（中）(RIPA Lysis Buffer)是采用一种经典的细胞组织快速裂解并获得总蛋白的裂解液，其裂解强度大于NP-40裂解液、RIPA裂解液(弱)。所获得的蛋白质可用于Western，免疫沉淀(Immunol Precipitation，IP)等。

Medium RIPA Lysis Buffer主要由Tris 、NP-40、sodium deoxycholate等组成，并含有多种蛋白酶抑制剂成分，可以有效抑制蛋白的降解，并维持原有的蛋白间相互作用。

为了实验方便，订购该试剂附送一支1.5mL的PMSF。

 

使用说明 ：

如发现RIPA有沉淀，请放室温半小时或者常温水浴使沉淀溶解。

根据使用量，取每1ml RIPA 加入10ul PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM，混匀备用 （PMSF现用现加）。

 

操作步骤(仅供参考)：

(一)贴壁培养细胞

1、取Medium RIPA Lysis Buffer置室温溶解混匀，加入PMSF，使PMSF终浓度为1mM。

2、去除贴壁细胞的培养液，用PBS、NS或无血清培养液清洗1次，低速离心，弃上清，留取沉淀。

3、按照6孔板每孔加入150～250μl含有PMSF的裂解液的比例，加入Medium RIPA Lysis Buffer 。移液器轻轻吹打，使裂解液和细胞充分接触。置于冰上或4℃裂解15～30min，通常裂解液作用于细胞1～3秒内，细胞就会被裂解。通常6孔板每孔细胞加入100μl解液已经足够，如果细胞密度很高可以适当加大裂解液的用量到200～250μl。

4、10000～12000g，4℃离心5～10min(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。

5、进行后续的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

 

(二)悬浮培养细胞

1、取Medium RIPA Lysis Buffer 置室温溶解混匀，加入PMSF，使PMSF终浓度为1mM。

2、低速离心悬浮细胞，弃上清，收集沉淀。

3、用手指轻弹细胞，使其松散。按照6孔板每孔细胞加入150～250μl含有PMSF的裂解液的比例，加入Medium RIPA Lysis Buffer 。通常6孔板每孔细胞加入150μl裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到200～250μl。再用手指轻弹以充分裂解细胞，充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。

4、10000～12000g，4℃离心5～10min(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。

5、进行后续的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

 

(三)组织样本

1、取Medium RIPA Lysis Buffer 置室温溶解混匀，加入PMSF，使PMSF终浓度为1mM。

2、把组织剪切成细小的碎片，越小越好。

3、取在液氮或超低温冰箱中冷冻30min以上的组织，迅速用液氮研磨，研磨过程尽量控制在1～2min之内，以减少蛋白的降解。

4、按照每20mg组织加入150～250μl裂解液的比例加入含有PMSF的裂解液。冰上或4℃裂解15～30min。

步骤3、4亦可以采用如下过程：按照每20mg组织加入150～250μl裂解液的比例，加入含有PMSF的Medium RIPA Lysis Buffer。用玻璃匀浆器或组织研磨器匀浆，直至充分裂解，该过程尽量控制在1～2min之内，以减少蛋白的降解。、

5、10000～12000g，4℃离心5～10min(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。

6、进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
 
注意事项

1、去除贴壁细胞的培养液后，如果血清中的蛋白没有干扰，可以不用清洗。

2、如果裂解不充分可以适当增加裂解液的用量，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。

3、如果细胞量较多，必需分装成50～100万细胞/离心管，然后再裂解。大团的细胞较难裂解充分，而少量的细胞由于裂解液容易和细胞充分接触，相对比较容易裂解充分。

4、如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈Vortex使样品裂解充分。然后同样离心取上清，用于后续实验。直接裂解的优点是比较方便，不必使用匀浆器，缺点是不如使用匀浆器那样裂解得比较充分。

5、溶解RIPA Lysis Buffer时，应尽量缩短溶解时间，避免有效成分失效。

6、裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物，属正常现象。该透明胶状物为含有基因组DNA等的复合物。在不检测和基因组DNA结合特别紧密的蛋白的情况下，可以直接离心取上清用于后续实验；如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理打碎打散该透明胶状物，随后离心取上清用于后续实验。如果检测一些常见的转录因子，例如NF-KB、p53等时，通常不必进行超声处理，就可以检测到这些转录因子。

细胞裂解的操作步骤，应置于冰上或4℃进行。
 
存储：冰袋运输，-20℃保存，有效期： 至少12个月。

 

 

产品名称	Western及IP细胞裂解液	RIPA裂解液(强)	RIPA裂解液(中)	RIPA裂解液(弱)	NP-40裂解液	SDS裂解液
有效裂解成分	1% Triton X-100	1% Triton X-100, 1% deoxycholate, 0.1% SDS	1% NP-40, 0.5% deoxycholate, 0.1% SDS	1% NP-40, 0.25% deoxycholate	1% NP-40	1% SDS
裂解强度	温和	强	中	温和	温和	强
对膜蛋白的提取	一般	很好	较好	一般	一般	很好
对胞浆蛋白的提取	很好	很好	很好	很好	很好	很好
对核蛋白的提取	较好	很好	较好	较好	较好	很好
胞浆磷酸化蛋白提取	很好	很好	很好	很好	很好	很好
细胞核转录因子提取	很好	很好	很好	很好	很好	很好
主要用途	WB, IP,co-IP	WB, IP	WB, IP	WB, IP, co-IP	WB, IP,co-IP	WB, ChIP