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- 2025年07月12日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 库存：
57
- 保质期：
详见说明书
- 供应商：
上海西格
- 保存条件：
详见说明书
- 规格：
50T
方法
1：在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer
5 μl dNTP mix （2mM）
4 μl 引物1（10pM）
2 μl 引物2（10pM）
2 μl Taq酶 （2U/μl）
1 μl DNA模板（50ng-1μg/μl）
1 μl 加ddH2O至 50 μl
视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
2：调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，在72℃ 保温7min。
3：结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
4：PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μl氯仿进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。
| 产品名称 | 猪源性成分探针法荧光定量PCR试剂盒说明书 |
| 英文名称 | |
| 货号 | XGR7450 |
| 循环步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
| 预变性 | 94℃ | 5 min | 1 |
| 变性 | 94℃ | 10 sec | 30-40 |
| 退火 | 50-65℃ | 20 sec | 30-40 |
| 延伸 | 72℃ | 30 sec/kb | 30-40 |
| 终延伸 | 72℃ | 5 min | 1 |
典型的PCR由
（1）高温变性模板；
（2）引物与模板退火；
（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：
将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93℃-94℃）使其变性解成单链；
人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；
耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链。
荧光定量PCR检测方法包括以下步骤：
(1)将参照基因与待测目的基因片段等比例连接，克隆到同一个质粒载体上，构建一种可同时用于参照基因以及待测目的基因扩增检测的标准品，并将所得标准品按照浓度梯度稀释后同时用于绘制参照基因以及待测目的基因的标准曲线；
(2)待测样本与步骤(1)所述标准品经同步进行实时荧光定量PCR扩增后，目的基因与参照基因按照各自的标准曲线计算各自的拷贝数，计算待测样本的目的基因与参照基因拷贝数比值，即得目的基因的拷贝数相对定量检测结果。
其中步骤(1)为：将参照基因与待测目的基因片段等比例连接，克隆到同一个质粒载体上，构建一种可同时用于参照基因以及待测目的基因扩增检测的标准品，并将所得标准品按照浓度梯度稀释后同时用于绘制参照基因以及待测目的基因的标准曲线。
其中所述参照基因为本领域常规参照基因，较佳地管家基因，优选地为RPPH1的扩增区域，其中所述质粒载体为本领域常规质粒载体，较佳地为PCR克隆载体，优选地为TA cloning载体，所述TA cloning载体较佳地为pMD18-T载体。其中所述标准品的核酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示。所述的等比例较佳地为1：1。由于标准品中待测目的基因与参照基因的比例为1:1，解决了目前相对标准曲线法应用中目的基因与参照基因的浓度比例关系难以控制的问题，提高HER2基因扩增检测的可靠性。
步骤(2)为：待测样本与步(1)所述标准品经同步进行实时荧光定量PCR扩增后，目的基因与参照基因按照各自的标准曲线计算各自的拷贝数，计算待测样本的目的基因与参照基因拷贝数比值，即得目的基因的拷贝数相对定量检测结果。
其中所述待测目的基因为本领域常规待测目的基因，较佳地为肿瘤或者疾病的特异性基因，更佳地为HER2基因的扩增区域，所述荧光定量PCR扩增为本领域常规荧光定量PCR扩增方法，所述荧光定量PCR扩增方法较佳地为多通道荧光定量PCR扩增，更佳地为双通道荧光定量PCR扩增。
以下是猪源性成分探针法荧光定量PCR试剂盒说明书的相关产品：
血琼脂平板Blood Agar Plate
其他中文名称： 哥伦比亚血琼脂平板
英文名称： Blood Agar Plate
产品： BR
包装：50块
级别：BR
尺寸：90mm/块
性状：无菌。
用途：生化研究。营养需求较高的细菌培养
保存：RT
2ˊ脱氧次核苷，英文名或英文缩写：2′Di，级别：BR，98%，规格：100毫克
00奎宁;金鸡纳碱;规宁;鸡钠碱;金鸡纳霜inoneine;inoneine base;(8α;9R)6′metxoxycinchonan9ol
FADNa2黄素腺嘌呤二核甙酸二钠100u超，98%，二水物
3,3二己基氧杂羰花青典化物 98% 3,3'DIHqXYLOXcCcRBOCYcNINq IODIDq
Dpxenylglycine本甘酸5克BR，99%
化shēng huà shì jì容量：RT1克
253223聚乙二醇3350Polyetxylene Glycol 3350;
1丙磺酸钠一水物，英文名或英文缩写：wo7ium 1propanesulfonate monohydrate，级别：BR，规格：100克
酵母浸粉 Yeast Extract Powder 80 250G 培养基
1，5二磺醋内 Diwo7ium 1,5ncphclqnqdisulfonctq 22
小鼠苗条素受体(Leptin receptor)ELISA试剂盒 ，英文名： Leptin receptor ELISA Kit
鸡5核苷酸酶(5-)ELISA检测试剂盒Chicken5-Nucleotidase,5-ELISAKit 96T/48T
人5羟色胺(5-HT)免疫试剂盒 Human 5-Hydroxyyptamine,5HT ELISA Kit
英文名称Mouseβ-ThromboglobulinELISAKit小鼠β血小板球蛋白(β-TG)规格：96T/48T
冰冻切片组织CDK6蛋白表达荧光显微镜检测试剂盒10/20次
RatCollagenaseIELISA试剂盒大鼠胶原酶I(CollagenaseI)ELISA试剂盒规格：96T/48T
猪源性成分探针法荧光定量PCR试剂盒说明书兔钩端螺旋体IgG(Lebtospira)ELISA 试剂盒 96T/48T 试剂盒 组装/原装
Rat glucagon like peptide 1 (Glp-1) ELISA Kit 大鼠胰高血糖素样肽1(Glp-1)ELISA试剂盒
Humanepidemicparotitis,EPELISAKit 人流行性腮腺炎(EP)ELISA试剂盒 96T/48T 进口分装
HumanglathioneS-ansferases,GSTsELISA试剂盒人谷胱甘肽S转移酶(GSTs)ELISA试剂盒规格：96T/48T
组织单胺氧化酶B型(MAO-B)活性化学发光法定量检测试剂盒20次
HumanMothersagainstdecapeaplegichomolog1,Smad1ELISAKit人Smad1ELISA试剂盒规格：96T/48T
操作步骤 :
1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer 5μl
dNTP mixl 4μl
引物1（10pM） 2μl
引物2（10PM） 2μl
Taq酶（2U/μl） 1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl
加ddH2O至 50 μl
视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
2．调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，zui后在72℃ 保温7min。
3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
4．PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μlLuFang进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。
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文献和实验如果您的样本是组织，取样的过程非常重要。组织内部是有内源性 RNase 存在的，组织离体后内源性 RNase 则开始发挥作用，RNA 产生降解。所以离体的组织必须立马放在液氮中速冻，之后转移至 -80℃ 长期保存，且避免反复冻融。研磨组织的过程中需要保证在液氮环境中研磨。RNA 提取的过程中，保证样本的上样量不超过提取试剂盒说明书中规定的最大上样量，上样量过多，同样会造成 RNA 降解。 ②如果您的样本是细胞，则样本搜集过程要简单的多了，只要保证细胞状态良好（细胞状态差也容易造成提取的 RNA 降解
或存放不当：质粒提取试剂盒成分复杂且保存条件不同，有的试剂还容易出现浑浊。在使用之前需要检查试剂是否保存得当，如果出现浑浊，可参考试剂盒说明书，进行 37℃ 温浴至溶液澄清，再冷却至室温使用。 ⑦洗脱液体积不合适：洗脱液使用体积过大会导致提取浓度偏低，过小会导致洗脱不充分，产量过低。建议参考试剂盒说明书来确定洗脱体积，如果洗脱浓度偏低，可以重复洗脱一次； ⑧洗脱液未添加到硅胶膜中心：可能会导致洗脱液覆盖不完全，导致洗脱效率降低。此外洗脱液可以使用碱性洗脱缓冲液或者无核酸酶的水，避免使用 PH＜
所特有的，下游引物为通用引物就可以了。 荧光定量PCR检测方法有SYBR Green染料法和TaqMan探针法。前者需要调整引物浓度以及引物扩增效率，把引物二聚体调整到越小越好；探针法则需要设计荧光探针，这其中由于MGB探针需要碱基数量少和特异性好的特点而被推荐。 探针设计位置有3个：完全与miRNA序列相同、在miRNA与RT引物的交叉点、完全在RT引物上；这其中又有正向和反向互补两种情况。至于探针要设计在那个位置，根据自己试验情况而定，本人以为效果都差不多。 四、试验操作流程
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