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- 供应商:
上海一研
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- 规格:
5ml
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参数规格:
产品名称 SABC-POD(过氧化物酶)
规格:5ml
操作程序:
注意:最重要的是及时固定,并在固定液中加入0.1%的DEPC处理,以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外,过度固定对原位杂交有明显的不利影响。
1.玻片的处理:一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2.细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养,条件为37℃和5%的CO2,所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3.培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定:固定液为4%/0.1 M PBS(PH7.2-7.6),含有1/1000 DEPC。室温固定 20--30分钟。蒸馏水充分洗涤,干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4.30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合,室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。
5.暴露mRNA核酸片段:切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶,混匀),37℃或室温消化5—120秒钟。有时也可以不消化。原位杂交用 PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
6.后固定:胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%/0.1 M PBS(PH7.2-7.6),含有1/1000 DEPC。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。
7.预杂交:湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体,不洗。
8.杂交——按每张切片20μι杂交液,加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后,盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
9.杂交后洗涤:揭掉盖玻片,37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次;37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色,重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。
10.滴加封闭液:37℃30分钟。甩去多余液体,不洗
11.滴加生物素化鼠抗37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12.滴加SABC:37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
13.滴加生物素化过氧化物酶:37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。
14.DAB显色:使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂A,B,C各一滴,混匀,加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。
15.必要时苏木素复染,充分水洗。
16.酒精脱水,二甲苯透明,封片。
试剂盒组份:
5×Equilibration Buffer————750μl
FITC-12-dUTP Labeling Mix———100 μl
Recombinant TdT Enzyme—————20 μl
Proteinase K (2 mg/ml)————40 μl
DNase I (1 U/μl)———————5μl
10×DNase I Buffer——————100 μl
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兔抗鸡IgM英文名称: Goat anti-BSA储存条件: -20°C分子式:C18H11NO5性状:Brown powder纯度:97.0%
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SABC-POD(过氧化物酶)3β-Isodihydrocadambine特异性: 人、大鼠、小鼠Aclenylylcyclase mRNA原位杂交试剂盒
Tyramine hydrochloride特异性: 人、大鼠、小鼠.兔Actin mRNA原位杂交试剂盒
Trolline特异性: 人ACTA2 mRNA原位杂交试剂盒
5-Carboxystrictosidine特异性: 人、大鼠、小鼠Actinin/Skeltal Muscle mRNA原位杂交试剂盒
4,5-Dihydropiperlonguminine特异性: 人、大鼠、小鼠Actinin/Smooth Muscle mRNA原位杂交试剂盒
14-O-Acetylneoline特异性: 蜜蜂ACOR1 mRNA原位杂交试剂盒
Sinomenine特异性: 人Activin A mRNA原位杂交试剂盒
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文献和实验一、原理AsA-POD催化AsA与H2O2反应,使AsA氧化成单脱氢抗坏血酸(MDAsA)。随着AsA被氧化,溶液中290nm波长下的消光值(A290)下降,根据单位时间内A290减少值,计算AsA-POD活性。AsA氧化量按消光系数2.8(mmol/L)/cm计算,酶活性可用每克鲜重每小时氧化AsA的微摩尔数μMol/g·H表示。二、仪器离心机;紫外分光光度计;研钵;试管。三、试剂50mmol/L K2PO4-KH2PO4缓冲液(PH7.0,内含0.1mmol/L EDTA-Na2)
实验原理 AsA-POD催化AsA与H2O2反应,使AsA氧化成单脱氢抗坏血酸(MDAsA)。随着AsA被氧化,溶液中290nm波长下的消光度值(A290)下降,根据单位时间内A290减少值,计算AsA-POD活性。AsA氧化量按消光系数2.8(mmol/L)/cm计算,酶活性可用μmolAsA/(g FW•h)表示。 实验试剂 50mmol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液(pH7.0,内含0.1mmol/L
SABC 法与其他免疫组织化学染色方法比较 SP法或SAP法 该法由于用链霉亲和素替代ABC法中的亲和素―生物素复合物,因此背景清晰,敏感性增加,无非特异性染色,阳性反应易于辨认。是目前最常用的方法。在操作步骤中,与SABC法相比,仅有一个步骤不同,即试剂盒中的链霉菌抗生物素―过氧化物酶替代了亲和素―生物 素―过氧化物酶。因此无需使用生物素阻断剂消除内源性生物素。SP法与SAP法的区别在于前者的放大系统为链霉亲和素―过氧化物酶,后者是链霉亲和素―碱性磷酸酶,故导致
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