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36
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详见说明书
- 供应商:
上海抚生
- 保存条件:
低温冷藏
- 规格:
100ml
规格: 100ml
别名 Paraformaldehyde,1%
储存条件 -20℃,有效期1年
单位瓶
产品说明:
固定的目的在于保存细胞和组织的原有形态结构,固定剂能阻止内源性溶酶体酶对自身组织和细胞的自溶、抑制细菌和霉菌的生长。固定液分为醛类固定液、汞类固定液、醇类固定液、氧化剂类固定液、盐类固定液等,较为常用的是醛类中的福尔马林、醇类中的乙醇。
多聚(1%PFA)主要由、磷酸盐、去离子水组成,该固定液适合于绝大多数组织和细胞的固定,是免疫组织化学和培养细胞的固定液之一
1. 样品染色
1) 将Binding Buffer(10×)稀释成1×Binding buffer工作液备用(1ml Binding Buffer(10×)需加入9ml无菌去离子水)。
2) 对于悬浮细胞,500-1000g离心5min收集细胞。
对于贴壁细胞,要用不含EDTA的胰酶消化细胞,胰酶消化时间不宜过长或过短,最好是在轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时,加入细胞培养液,将细胞轻轻吹打下来,转移到离心管内,500-1000g离心5min收集细胞。
3) 收集细胞后,加入预冷PBS溶液轻摇或用移液器轻柔吹打洗涤,离心收集细胞,共洗涤两次。
4) 在细胞沉淀中加入1×Binding buffer工作液,重悬细胞,使细胞浓度达到1×106 cell/ml。
5) 吸取100μl细胞悬液(细胞总数为1×105 cell)至一新管中,加入5μl Annexin V-FITC和5-10 μl PI,轻轻混匀,室温避光孵育15min。
2. 样品检测
1) 流式细胞仪检测:
染色孵育后,每管加入400μl 1×Binding Buffer工作液,混匀后使用流式细胞仪检测(1小时内检测)。
建议设置经凋亡诱导的正常细胞、PI单染和Annexin V-FITC单染3个对照组,正常细胞组可作为荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。结果可用CellQuest等软件进行分析,绘制双色散点图(two-color dot plot),FITC为横坐标,PI为纵坐标。Annexin V-FITC和PI联合使用时,活细胞仅有很低强度的背景荧光,早期凋亡细胞仅有较强的绿色荧光,晚期凋亡细胞有绿色和红色双重荧光。
2) 荧光显微镜检测:
染色孵育后涂片,显微镜下观察。使用荧光显微镜上的蓝光和绿光通道分别观察FITC和PI。被Annexin V-FITC结合的细胞显示浆膜上有绿色光环。丧失细胞膜完整性的细胞,细胞核显示红色,膜上有绿色光环。
1. 整个操作过程动作要尽量轻柔,勿用力吹打细胞,尽量在4℃下操作。
2. 反应完毕后请尽快检测,反应1 小时后荧光强度就开始衰变。
3. Annexin V-FITC 和 Propidium iodide 是光敏物质,在操作时请注意避光。
4. 试验操作过程中佩戴手套等防护用品。
5. 试验开始前将一定量的 10×Annexin V Binding Buffer 用超纯水(1:9)稀释至 1×备用。
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文献和实验或终止内源性或外源性细胞内分解酶的反应,防止组织细胞自溶,更是为了保存组织或细胞内的抗原性,使抗原不失活,不发生弥散。不同的抗原对固定液耐受程度不同,因而要选择合适的固定剂。 现在常用的固定剂有中性甲醛液,4% 多聚甲醛-磷酸盐缓冲液。有些固定剂对特殊组织有更好效果,如苦味酸对于头皮、指甲固定有软化效果,Helly 固定液对于胰岛和垂体效果较好,PLP 固定液对于含糖组织抗原保存更好。 脱水、石蜡包埋和制片 脱水用梯度乙醇(由低到高)充分脱水,对于一些易脆的组织(如肝、脾等)应减少高浓度酒精里
FITC 标记凝集素的组织化学染色程序1.组织切片经脱蜡处理,若是Bouin液固定的组织,用70%乙醇洗3次除去组织切片内的黄色后,再用蒸馏水漂洗;2.PBS漂洗(含1%牛血清白蛋白)2次,每次5分钟;3.加入FITC-凝集素(PBS适当稀释),置湿盒内孵育,室温1小时;4.PBS漂洗3次,每次5分钟;5.水溶性封片剂封片,荧光显微镜观察。6.结果 FITC标记的凝集素能直接与组织细胞内的糖基结合,从而显示糖基的位置,可用于检测组织细胞中的糖成分,阳性部位呈黄绿色荧光。7.注意
95%乙醇脱水性强,易引起组织收缩、变硬,影响切片质量,因而固定时间不宜过长(2小时内)。乙醇使蛋白变性程度轻,固定后蛋白可再溶解,在染色中孵育时间长的情况下,抗原可流失,并减弱反应强度。 5.乙醚(或三氯甲烷) 与乙醇等量混合对组织穿透性极强,即使涂片上含较多的黏液,固定效果仍较好,是理想的细胞固定液。 培养细胞固定之后晾干可使细胞牢固地黏附在载玻片上,故对于容易脱落的细胞应延长晾干时间。晾干之后PBS漂洗3次,然后进行组织化学或免疫组织化学染色。 用于免疫
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