钙黄绿素深红色衍生物(≥95%(HPLC))

特别提示：包括钙黄绿素深红色衍生物在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：钙黄绿素深红色衍生物
英文名称：Deep Red Calcein,AM
产品货号：KM0104
产品规格：1mg

本制品自身无荧光，具有细胞膜渗透性。能够轻易进入活细胞，被细胞内酯酶水解生成钙黄绿素深红，产生强烈的深红色荧光（Ex/Em=646/659），用标准的Cy5滤片设置检测。

Calcein,AM是一种具细胞膜渗透性zuì受欢迎的活细胞荧光染料，用来标记和监测活细胞功能，呈绿色荧光（Ex/Em= 490nm/515nm）。然而，Calcein,AM单一颜色使其不能将其用在多重标记实验，比如，其无法和GFP转染细胞联合使用，因光谱一致。为了解决这一应用缺陷，我司特别开发出Red Calcein（货号：KM0178），Deep Red Calcein（货号：KM0104）这些衍生物，能够联合GFP或FITC等荧光素实现对活细胞的多重标记和功能分析。

应用实例：

HeLa细胞经Deep Red Calcein（#KM0104）染色的图片。

主要参数：
分子量：500
纯度：≥95%（HPLC）
Ex/Em：647/659nm
溶解性：溶于DMSO（1~5mM）
保存：-20℃干燥保存，避免强光直射，有效期一年。

注意事项：
1．荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
2．本品从冰箱取出后请在干燥的环境放至室温后再开封。由于试剂微量，开封前请将其短暂离心，以保证粉末落入管底。
3．本品对湿度非常敏感，粉末保存一定要保持干燥。储存液需要分装避光冻存，且必须紧紧密封盖子，干燥保存。工作液必须现配现用。
4．为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法：

一、储存液制备
储存液配制范围可为2～5 mM，具体根据工作浓度来决定，建议提前配制成1000×储存液。若使用的工作液为5μM，那么可配制5mM的储存液，即往1mgDeep Red Calcein（Mw：500）内加入400μl细胞培养级别的DMSO（货号：KM0186）即可。储存液需要根据单次用量分装，-20℃避光干燥保存，一定要避免受潮，此种情况下可稳定保存数月。

二、染色工作液制备
于正式实验前，或溶解Deep Red Calcein粉末配制储存液，或取一管已配制好的Deep Red Calcein储存液并回至室温使充分融化。用添加有2.5mM丙磺舒的HHBS（Hanks with 20mM Hepes buffer）或其他适当的缓冲液（pH 7.0）稀释储存液到5~10μM工作浓度。
注1：Deep Red Calcein染色工作液很不稳定，需要使用前配制。
注2：许多细胞都含有机阴离子转运体。因此高度推荐染色工作液内添加2.5mM丙磺舒（有机阴离子转运体抑制剂），以防止荧光探针泄露到细胞外。

三、染色步骤
以下是基于96孔板的Deep Red Calcein活细胞染色步骤，仅作参考。具体实验请根据自身要求做调整。
1．细胞准备：于黑框/透明底的96孔微孔板内按照100~10,000个细胞/孔的量铺板。设置空白孔（不含细胞的培养基）。
  注意：每种细胞系需要根据实际情况来确认细胞增殖或细胞毒性诱导的zuì佳细胞密度。增殖分析，细胞密度相对少些；毒性分析，起始细胞密度高些。建议96孔板的单孔体积为100μL。
2．药物处理：加待测药物到细胞内处理适当时间（比如24h，48h或96h）。设置空白孔（不含细胞的培养基），加入相应量的待测药物。
  注意：药物添加前可不用清洗细胞。然而，若是药物是血清敏感性，那在添加药物前需要吸掉生长培养基和血清因子。替换之细胞用无血清培养基培养。
3．吸掉培养基。
  注意：探针加载前必须去除培养基
4．按照100μL/孔（96孔板）的量加入Deep Red Calcein染色工作液。
5．室温或37℃避光孵育1h。
  注意1：适当的孵育时间取决于细胞类型和使用的细胞浓度。每个实验建议进行孵育时间优化。
  注意2：对于悬浮细胞，探针孵育结束后，于800rpm离心2min。
6．用含合适滤光片（Ex/Em= 635nm/670nm）的仪器进行荧光检测。
  注意：如果荧光背景高，可在荧光信号检测前用含2.5mM丙磺舒的HHBS缓冲液替换Deep Red Calcein染色工作液。

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