HRM分析试剂盒（染料法)北京厂家

特别提示：包括HRM分析试剂盒（染料法)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：HRM分析试剂盒（染料法)
英文名称：HRM Analysis Kit （EvaGreen)
产品货号：WH0112
产品规格：20μl×125次|20μl×500次

本试剂盒结合了饱和染料EvaGreen和抗体酶的优点，是一款适用于高分辨率熔解曲线（High Resolution Melting，HRM）分析的专业试剂盒。本品是一种2× PreMix，PCR反应液配制十分简单方便；具有分辨率高和模板高度适应性等特点。与SYBR Green不同，EvaGreen在高浓度情况下不会抑制PCR反应；可以使双链PCR产物的结合量达到饱和状态，所以称为“饱和染料”。不会产生SYBR Green的“染料重排”现象，能够很好的区分扩增产物之间单个碱基的差异。本产品可用于已知SNP分析，未知SNP筛选，以及未知突变基因扫描和甲基化PCR分析等研究。

产品特点：
·高分辨率：采用EvaGreen饱和染料，在饱和状态下具很高的熔解曲线分辨率，可以区分单个碱基的变异。
·高特异性：采用抗体修饰的热启动DNA聚合酶，降低非特异性扩增，提高特异性。
·高稳定性：精心优化Buffer体系，增加了熔解曲线的稳定性，提高结果可信度。
· ROX校正：单独包装的ROX染料，使用更灵活，结果更准确。

试剂盒原理：
SYBR Green是目前被广泛应用于荧光定量PCR分析的荧光染料，但由于对PCR的抑制较严重，会被控制在较低的使用浓度，SYBR Green与双链DNA的结合处于非饱和状态，所以称为“非饱和染料”。SYBR Green的这种性质会导致在“染料重排”现象的发生，从而影响熔解曲线的分辨率，所以不能够通过熔解曲线区分扩增产物之间单个碱基之间的差异。
EvaGreen是一种同时适用于荧光定量PCR和HRM分析的新一代染料。这种染料通过一种被称为“按要求释放”的全新机制，选择性的结合双链DNA。这一机制保证了较低的PCR抑制作用，同时也允许在染料饱和浓度下进行分辨单碱基差异的HRM分析。

试剂盒组成：

组分	20μl×125次	20μl×500次
2× HRM Analysis PreMix	1.25ml	4×1.25ml
50×ROX Reference Dye	250μl	1ml
RNase-Free ddH2O	2×1ml	5×1ml

储存条件：收到本产品后，请立即置于-20℃避光保存。从-20℃取出使用时，将冻存的2× HRM Analysis PreMix和50×ROX Reference Dye溶解，然后轻轻颠倒混匀，待溶液完全均一后再行使用。如解冻后没有使用，须彻底混匀后重新冷冻（在解冻过程中盐会出现分层现象，未混匀进行冷冻，盐晶体的析出将会对酶造成损害)。如需一段时间内经常取用，可在2～8℃条件下储存3个月。避免反复多次冻融。

注意事项：
1．本产品中含有荧光染料EvaGreen，保存本产品或配制PCR反应液时应避免强光照射。
2．如果试剂没有混匀，其反应性能会有所下降。使用时请上下颠倒轻轻混匀，请不要使用振荡器进行混匀，尽量避免出现泡沫，并经瞬时离心后使用。
3．引物纯度对反应特异性影响很大，建议使用PAGE级别以上纯化的引物。
4．20μl反应体系中，基因组DNA模板的使用量一般小于100ng，并尽量保持不同反应之间有相同的模量。模板纯度，OD₂₆₀/280 1.6~2.0，OD₂₆₀/230 1.5~2.0。
5．由于HRM具有很高的灵敏性，因此在条件允许的情况下推荐使用50μl反应体系，大的反应体系可以提高反应重复性，减少实验误差对熔解曲线的负面影响。
6．引物设计：较短的PCR产物可以提高HRM的分辨率；因此在设计PCR引物时，遵循普遍的原则外，尽量保持产物长度在80~120之间。SNP位点尽量处在PCR产物序列中间位置。

操作步骤：
一、建立HRM PCR反应体系：
请注意将2× HRM Analysis PreMix和50×ROX Reference Dye避光保存。
1．溶解2× HRM Analysis PreMix （如果保存在-20℃)，50×ROX Reference Dye，模板，引物和RNase-Free ddH2O，并将所有试剂在室温下平衡并彻底混匀。
2．建议置于冰上进行HRM PCR反应液的配制，反应体系如下：

成分	50μl体系	20μl体系	终浓度
2×HRM Analysis PreMix	25μl	10μl	1×
正向引物（10μM）	1.5μl	0.6μl	0.3μM①
反向引物（10μM）	1.5μl	0.6μl	0.3μM①
模板②	－	－	－
50×ROX Reference Dye③	－	－	－
RNase-Free ddH2O	至50μl	至25μl	－

常用体系为20 ul，在条件允许的情况下可50μl反应体系，大的反应体系可以减少实验误差对熔解曲线的负面影响。
①引物终浓度为0.3μM可以在大多数体系中获得良好的扩增结果。扩增效率不高时，可增加PCR反应体系中的引物浓度；发生非特异扩增时，可适当减少PCR反应体系中的引物浓度。需要进一步优化引物浓度的，可以在0.2～0.5 μM范围内调整。
②由于HRM反应较灵敏，须尽量保持不同样本之间有相同的模板量。
③几种常见仪器的最适ROX Reference Dye浓度如下：
  ABI 7900HT：5×（例如：5μl ROX/50μl体系）
  ABI 7500 Fast：1×（例如：1μl ROX/50μl体系)；
  Roche LightCycler 480，Qiagen Roter-Gene：不用添加。
二、进行PCR反应
建议采用两步法PCR反应程序进行反应。当出现模板浓度过低引起非特异扩增，引物Tm值较低导致的扩增效率低下或扩增曲线重现性不佳等现象时，建议尝试进行三步法PCR扩增反应。
两步法反应程序：

阶段	循环	温度	时间	内容	荧光信号采集
预变性	1×	95℃	2min	预变性	否
PCR反应	40×	95℃	10sec	变性	否
		60℃④	30sec	退火/延伸	是
熔解曲线分析（Melting/Dissociation Curve Stage）⑤

三步法反应程序：

阶段	循环	温度	时间	内容	荧光信号采集
预变性	1×	95℃	2min	预变性	否
PCR反应	40×	95℃	10sec	变性	否
		60℃	20sec	退火	否
		72℃	30sec	延伸	是
熔解曲线分析（Melting/Dissociation Curve Stage）⑤

④请先使用60℃ 30sec进行扩增，如出现非特异性扩增，可尝试在60-66℃范围内优化，提高反应特异性。
⑤ HRM在熔解曲线分析时，一般设置为0.02～0.1℃收集一次荧光。
3．盖上反应管，轻柔混匀。可短暂离心，确保所有组分均在管底。
4．将反应体系置于荧光定量PCR仪中，开始反应。

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