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QuickMutation™基
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碧云天(beyotime)
10次
碧云天生产的QuickMutation™基因定点突变试剂盒(QuickMutation™ Site-Directed Mutagenesis Kit)可以快速完成质粒DNA的点突变(point mutation),多个邻近密码子的突变,单个或多个邻近密码子的缺失(deletion)或插入(insertion)突变。基因定点突变常用于研究基因的转录调控、RNA或蛋白质的结构和功能,以及用于质粒中部分序列的微调等。本试剂盒利用了目前最常用的基因点突变技术,只需通过基于PCR的突变质粒的生成,和基于DpnI的模板质粒的消化,转化培养以及后续的酶切或测序鉴定,即可得到预期的突变质粒 (参考图1)。DpnI消化仅需5分钟,累计操作时间不足2小时即可完成基因的定点突变。
图1.基因定点突变试剂盒原理图
本试剂盒使用了保真性更强,灵敏度更高,扩增速度可达2kb/min,扩增长度可达12kb的BeyoFusion™ DNA Polymerase,从而大大缩短了突变反应所需的时间,进一步提高了基因定点突变的成功率。同时进一步严格验证了试剂盒中的DpnI,确保能在5分钟内充分消化掉甲基化的模板质粒,同时不会消化未甲基化的PCR产物。参考图1,使用本试剂盒时需要先设计长度通常为25-45个碱基互补的两个引物,在引物中含有预期的突变位点。然后以待突变的质粒为模板,用这两个引物进行PCR扩增反应。这样可以产生含有预期的突变位点的双链质粒,但这个双链质粒中有两个nick位点。待突变的质粒通常来源于DH5α等dam+大肠杆菌,在这些dam+细菌中质粒会被甲基化修饰,而在体外通过PCR扩增得到的质粒不会被甲基化。这样用特异性识别甲基化位点的酶DpnI处理,可以消化掉待突变的质粒模板,而使通过PCR扩增出来的含有突变位点的质粒被选择性地保留下来。随后把DpnI处理过的产物转化感受态细菌后,突变质粒中的两个nick位点可以被大肠杆菌修复,得到的克隆就会含有预期的突变质粒了。本试剂盒提供了DH5α甘油菌,可用于感受态细菌的制备。本试剂盒分别使用6kb和12kb的质粒进行了点突变测试,实测突变率接近100%(参考图2)。实际进行点突变时,可能会因为突变引物的设计、模板使用量、感受态效率等因素出现不同的突变率。
图2. 本试剂盒实际使用效果图。A. 使用本试剂盒进行点突变获得的LB平板照片。以一个6kb质粒为模板,使用本试剂盒进行PCR扩增以实现点突变,DpnI 37℃消化5min,取10μl产物转化100μl DH5α感受态,涂板后37℃培养过夜所获得的LB平板照片。B. 阴性对照LB平板照片。与A相比没有添加BeyoFusion™ DNA Polymerase,这样模板质粒完全被DpnI酶所消化,没有任何的假阳性克隆产生。C. 突变前后的测序图。突变前的测序结果(WT, wild type)和从图A中挑取9个克隆的测序结果(Mu,mutant)。箭头所示为拟突变的位点,红色下划线的为突变前和突变后的碱基。本次实验的突变率达到了100%。
本试剂盒共可以进行十次基因定点突变反应。
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