Power Green qPCR Mix

Power Green qPCR Mix

产品简介

Power Green qPCR Mix是2×浓缩的实时定量PCR预混液，使用时只需加入模板和引物即可进行反应。本品中的DNA聚合酶是新一代类抗体技术修饰的Hotstart Taq DNA聚合酶，在室温下活性被完全抑制，从而可以在室温下配置反应液。采用这种热启动机制可以显著提高定量PCR的特异性、扩增效率，得到更广的可定量扩增区域。本品采用了新的增强剂，对各种目的片段PCR效率的波动可控制在最小范围内，反复冻融对扩增性能影响极小。本品可与常见定量PCR仪完美兼容，如ABI、Roche、Bio-Rad等。

产品组成

 

Component	ZY2101	ZY2102	ZY2103	ZY2104	ZY2105
2X Power Green qPCR Mixa	1 ml	1 ml × 5	1 ml × 10	1 ml × 50	1 ml × 100
超纯水	1 ml	1 ml × 5	-	-	-

a.包含SYBR^® Green I，Hotstart Taq DNA聚合酶，Aptamer，dNTP及反应缓冲液等。

保存条件

Power Green qPCR Mix -20℃避光保存2年，4℃避光可短期保存。

质量控制

纯度检测：经质量检测，产品不含脱氧核糖核酸内切酶、脱氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶污染。

功能检测：经不同来源的模板和引物检测，产品具有优秀的特异性、灵敏性及可重复性等。

应用举例

1. 配制反应体系

Component	Volume		Final   concentration
DNA template[1]	0.5-2 μl	1-4 μl	Variable
Forward primer (10 μM)[2]	0.2 μl	0.4 μl	0.2 μM
Reverse primer (10 μM)	0.2 μl	0.4 μl	0.2 μM
2X Power Green qPCR Mix[3]	5 μl	10 μl	1X
ddH2O	Variable	Variable	-
Total volume[4]	10 μl	20 μl	-

[1] DNA模板建议用量（10-20 μl体系）：1-10 ng cDNA，或10-100 ng gDNA。加样体积不宜过小，以免造成较大的误差，但是cDNA的量不宜超过总体积的1/10。因此模板建议浓度（加样前）：cDNA 1-10 ng/μl，gDNA 10-100 ng/μl。

[2] 引物终浓度建议范围：0.2-0.6 μM。特异性差时可降低浓度，效率低时可提高浓度。

[3] 如果熔解曲线出现杂峰，可以减少Mix用量至8 μl（20 μl体系）；如果对痕量模板的检出率较低，可以增加Mix用量至12 μl（20 μl体系）。

[4] 建议总体积不小于10 μl，以免造成较大的加样误差。具体体积范围参考仪器说明。

注意：对于某些固定型号的仪器，需要添加ROX才能精确测定Ct值。ROX会给熔解曲线分析造成一定的背景干扰。因此，为了避免ROX的杂峰背景干扰，在应用软件的“Passive Reference Dye”中不要选择检测ROX荧光值选项，然后再进行数据的收集与分析。由于ROX的使用体积较小，建议将ROX提前与qPCR Mix混匀使用。ROX用量参照具体仪器说明，下表仅供参考。

Instruments	ROX (100X)
ABI PRISM 7000/ PRISM   7700/ 7300/ 7900HT/ Step One/ Step One Plus/ GeneAmp 5700	1-2% (High ROX)
ABI 7500/ 7500   Fast/ ViiA 7/ QuantStudio 6/7/12K Flex; Agilent Stratagene Mx3000P/ Mx3005P/   Mx4000	0.2% (Low ROX)
Bio-Rad CFX96/   CFX384/ iQ/ iQ5; MJ Research Opticon 2/ Chromo 4; Roche LightCycler 480/ 96;   Corbett Rotor Gene G/ Q/ 3000/ 6000; Thermo PikoReal 96; Eppendorf   MasterCycler ep realplex; Cepheid Smart Cycler	No ROX

2. 设定反应程序进行qPCR反应

注：本品含有热启动酶，在60℃时会抑制酶活性，因此不建议使用两步法，推荐使用经典三步法或极速三步法。

经典三步法程序如下：

Stage	Temperature	Time	Cycle
Initial denaturation	94℃	3 min	1
Denaturation	94℃	15 sec	40
Annealing	55-65℃[1]	15 sec
Extension	72℃	20 sec
Dissociation/Melting curve analysis（optional）[3]

本品可用极速三步法快速完成反应，程序如下：

Stage	Temperature	Time	Cycle
Initial denaturation	94℃	3 min	1
Denaturation	94℃	5 sec	40
Annealing	55-65℃[1]	5 sec
Extension	72℃	5-10 sec[2]
Dissociation/Melting curve analysis（optional）[3]

[1] 最适退火温度需要摸索。退火温度一般设定为所用引物的Tm-5℃，若低于55℃，则以Tm值为退火温度，一般不低于55℃。

[2] 150 bp以内的扩增子可设置为5 sec；150-300 bp的扩增子可设置为10 sec；300 bp以上的扩增子可适当延长时间。

[3] 不同仪器熔解曲线采集程序不同，一般按仪器默认熔解曲线采集程序即可。可在延伸（三步法）或退火延伸（两步法）阶段采集信号，也可在反应结束后72 hrs之内采集（避光低温保存）。

3. 分析结果

观察扩增曲线；调整基线，计算Ct值；观察熔解曲线检测特异性；进行相对或绝对定量。

注意事项

 使用前Mix需要完全解冻，充分混匀。尽量避免多次反复冻融。短期使用可避光保存于4℃。

 将（n+x）份反应液混匀后再分注到n个单管中，可降低加样误差。（n为重复次数，x为损耗量，一般为n的1/10）

 ABI的定量仪器大部分需要ROX校正管间差异，Bio-Rad的定量仪器不需要ROX校正。具体仪器请参照其使用说明。

 轻轻混匀反应液，避免产生气泡，气泡会干扰荧光检测。可瞬时离心去除气泡。

 引物的特异性、用量以及退火温度是影响实验结果的重要因素。务必设计特异性好的引物，随实验结果适当调整引物用量（0.05-0.9 μM）——特异性较差时减少引物用量，或以3℃为增量提高退火温度，扩增效率较低时增加引物用量。

 DNA模板的量应小于500 ng/反应，过高的模板量会引起非特异性扩增。应根据模板类型与基因表达量适当调整用量。

 熔解曲线的采集不是必须的，初次使用的引物建议进行熔解曲线采集。熔解曲线可以看出产物的特异性。产物特异性不好的原因有：引物特异性低；退火温度设置偏低；引物/模板浓度偏高；等。同时，建议通过琼脂糖凝胶电泳检测产物的特异性。