硫氧还蛋白还原酶(TrxR)活性检测试剂盒

硫氧还蛋白还原酶（TrxR）活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法

注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
货号：BC1150
规格：50T/48S

产品内容：
试剂一：液体 90mL×1 瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×1 瓶，4℃避光保存。临用前加入 5 mL 蒸馏水溶解。
试剂三：粉剂×1 瓶，4℃避光保存。临用前加入 5 mL 蒸馏水溶解。
试剂四：液体×1 支，-20℃避光保存。

产品说明：
TrxR 是一种 NADPH 依赖的包含 FAD 结构域的二聚体硒酶，属于吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶家族成员，与硫氧还蛋白以及 NADPH 共同构成了硫氧还蛋白系统。TrxR 与 GR 活性类似，催化 GSSG 还原生成 GSH，是谷胱甘肽氧化还原循环关键酶之一。TrxR 催化 NADPH 还原 DTNB 生成 TNB 和 NADP+，TNB 在 412 nm 有特征吸收峰，但还原型谷胱甘肽与 DTNB 同样能反应生成 TNB，因此本试剂盒利用 2-乙烯吡啶抑制样品中原有的还原型谷胱甘肽，通过测定 412nm 波长处 TNB 的增加速率，即可计算 TrxR 活性。

自备仪器和用品：
可见分光光度计、低温离心机、可调节移液器、研钵/匀浆器、1mL 玻璃比色皿和蒸馏水。

操作步骤：
一、粗酶液提取：
1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10 的比例（建议称取约0.1g 组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。10000rpm，4℃离心10min，取上清置冰上待检测。
2. 细菌、细胞：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1 的比例（建议500 万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3s，间隔7s，总时间3min），然后10000rpm，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
3. 测定前将上清液与试剂四以50：1的体积比混匀（即取100µL上清液加入2µL试剂四混合）37℃水浴30min后至冰上。

二、TrxR 测定操作：
1. 分光光度计预热 30 min 后，调节波长到 412nm，用蒸馏水调零。
2. 试剂一在 25℃（一般物种）或者 37℃（哺乳动物）预热 30min。
3. 空白管：取 1mL 玻璃比色皿，加入 100µL 试剂二，100µL 试剂三，800µL 试剂一，迅速混匀后于 412 nm 测定 10 s 时吸光度，然后将比色皿放入 37℃水浴 5min 后混匀立即测定 310 s 吸光度，记为 A1 和 A2。△A 空白管=A2-A1。
4. 测定管：取 1mL 玻璃比色皿，加入 100µL 试剂二，100µL 试剂三，700µL 试剂一，100µL 上清液，迅速混匀后于 412 nm 测定 10 s 时吸光度，然后将比色皿放入 37℃水浴 5min 后混匀立即测定 310s吸光度，记为 A3 和 A4。△A 测定管=A4-A3。

三、TrxR 活性计算：
（1）按蛋白浓度计算
活性单位定义：在 25℃或者 37℃中，每毫克蛋白每分钟生成 1nmol TNB 为一个酶活力单位。

TrxR（U/mg prot）=（△A 测定管-△A 空白管）÷(ε×d)×V 反总×109÷(Cpr×V 样)÷T
=147×（△A 测定管-△A 空白管）÷Cpr
（2）按样本鲜重计算
活性单位定义：在 25℃或者 37℃中，每克样品每分钟生成 1nmol TNB 为一个酶活力单位。
TrxR（U/g 鲜重）=（△A 测定管-△A 空白管）÷(ε×d)×V 反总×109÷(V 样÷V 样总×W)÷T
=147×（△A 测定管-△A 空白管）÷W
（3）按细胞数量计算
活性单位定义：在25℃或者37℃中，每104个细胞每分钟生成1nmol TNB为一个酶活力单位。
TrxR（U/104 cell）=（△A 测定管-△A 空白管）÷(ε×d)×V 反总×109÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T
= 147×（△A 测定管-△A 空白管）÷细胞数量

ε：TNB 在 412nm 处的摩尔消光系数，1.36 ×104 L/ mol/cm；
d：比色皿光径，1cm；
V 反总：反应体系总体积，1000µL=0.001L；
Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定；
V 样：加入反应体系中上清液体积，100µL=0.1 mL；
T：反应时间，5 min；
W：样品鲜重，g；
V 样总：提取液体积，1mL；
细胞数量：以 104为单位，万个。

注意事项：
1、哺乳动物组织及血液制品 TrxR 活力测定时，一般须用蒸馏水稀释 5 倍左右；测定过程操作须迅速。
2、由于提取液中含有一定浓度的蛋白（约 0.1mg/mL），所以在测定样品蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。